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研究背景疼痛是一种与组织损伤或潜在的损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验,疼痛带有强烈的情感成分,疼痛与负性情绪之间相互影响,压力可以抑制或加重疼痛,焦虑抑郁状态常常与更强烈的疼痛感受相关,尤其在慢性疼痛中,慢性痛在原发损伤消失后依然存在,然而,疼痛、恐惧、焦虑抑郁、认知和行为的复合机制还是个未解之谜。功能磁共振成像的结果表明没有慢性痛病史的个体与有疼痛恐惧躲避行为慢性腰痛患者杏仁核的激活有区别,同时两者杏仁核与前扣带回联系也不同。杏仁核还参与条件性恐惧行为的情感处理过程,而且处理疼痛记忆和痛动机。杏仁核参与了神经病理性痛疼痛信息的处理和神经可塑性过程,对杏仁核在疼痛过程中的作用研究可以让我们更好的认识疼痛机制。相关研究表明,内源性阿片系统参与疼痛调节的应激反应和情绪反应,阿片u受体的激活与痛感觉和情感评级的降低有关。α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPAR)介导中枢神经系统快速兴奋性突触传递,是主要的突触后谷氨酸兴奋受体,其GluAl亚型参与调节抑郁样行为反应。突触素(Synaptophysin, p38)几乎存在于所有神经终末的突触囊泡上,与神经递质的释放、突触可塑性变化密切相关。细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated Kinase, ERK 1/2)是Mitogen-activated protein kinase (MAPK)家族中重要成员,可响应神经递质、肽类激素、生长激素等等释放,介导(mediate)激酶RSK2(ribosomal S6 kinases,ERK的下游激酶)的活动,通过环腺苷酸反应元件结合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein, CREB)的磷酸化,进而启动多种功能蛋白。这个过程广泛存在于在突触长时程可塑性改变和长时记忆的形成中,相关研究表明ERK-CREB通路不仅参与痛的感觉成分还参与痛情绪成分。慢性疼痛临床上常常伴随着负性情绪和认知行为异常,而不良情绪常常对慢性疼痛的产生和维持起到促进作用。慢性疼痛的治疗常常采取手术和药物的疗法,而其治疗效果不是很令人满意而且常常伴随比较多的副作用。针刺在中国有着几千年的漫长发展历程,临床研究报道针刺可以调节慢性疼痛及其伴随负性情绪。实验研究在慢性痛动物模型上观察到了针刺对慢性疼痛痛感觉方面有着较好作用,而针刺对痛情绪方面的作用机制研究由于需要尽可能模拟临床症状的动物模型和检测方法等的限制报道较少。我们之前在慢性痛结合负性情绪大鼠模型上的研究表明针刺可以改善痛的感觉成分及情绪成分的行为学反应,其机制有可能与降低CCI大鼠杏仁核内N-methyl-D-aspartate (NMDA)受体亚单位NR2A、NR2B、促皮质激素受体CRF-2R基因表达,上调神经痛负性情绪大鼠杏仁核CRF-2R、NR2B;γ氨基丁酸受体GABAaR、GABAcR基因表达相关,而其具体机制复杂,有待进一步研究。因此本实验在左侧坐骨神经结扎造成慢性痛,条件位置厌恶诱发负性情绪的大鼠模型上采用行为学观察电针“足三里-阳陵泉”对动物痛行为的感觉成分和情感成分的影响,并同时采用免疫荧光技术、免疫印迹技术观察杏仁核介导的痛感觉和情绪成分相关蛋白谷氨酸AMPA受体亚型GluA1、阿片μ受体(μ-opioid receptor)、突触素(Synaptophysin)、磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorelated-extracellular signal-regulated kinase, p-ERK1/2)、磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(phosphorelated-cAMP response element binding protein, p-CREB)变化的分子生物学机制,并采用μ-阿片受体拮抗剂D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thra-mide (CTOP, a selective mu opioid receptor antagonist)、GluAl拮抗剂N-[3-[[4-[(3-Aminopropyl)amino] butyl]amino]propyl]-1-naphthaleneacetamide trihydrochloride (NASPM)杏仁核内微量注射等验证法,分析电针缓解慢性痛不同方面的机制,为针灸临床治疗慢性痛提供理论依据。材料与方法第一部分实验：Wistar雄性大鼠(230-260g)分为4组：正常组,CCI+NA(负性情绪negative affection)模型组,CCI+NA+电针(EA)组,CCI+NA+麻醉电针(AEA)组,每组8只。正常组除外,其余各组大鼠均实施左侧坐骨神经结扎术造成慢性痛,继而条件控制箱足底电刺激造成负性情绪模型。电针组和麻醉电针组电针刺激双侧“足三里”、“阳陵泉”,1mA,2/15Hz,每天1次,每次30分钟,共7天。电针干预后,即刻将放入条件控制箱。痛感觉维度采用痛觉测定仪测定大鼠双侧足底热辐射痛阈值,并取其健侧减患侧差值(PWLD),痛情绪方面测定大鼠在条件控制箱(CPA)停留时间。分别采用免疫荧光技术(6只鼠/组)、免疫印迹技术(6只鼠/组)观察杏仁核介导的痛感觉和情绪成分相关GluA1, μ-opioid receptor, Synaptophysin, p-ERK1/2, p-CREB蛋白的表达。第二部分实验：本实验使用30只雄性Wistar大鼠,随机分成5组：正常组,NA(负性情绪negative affection)模型组,NA+电针(EA)+生理盐水(NS)组,NA+EA+CTOP组,NA+EA+NASPM组,每组6只(数据完整为每组4只)。正常组除外,其余各组均行左侧坐骨神经结扎术结合条件控制箱3天足底电刺激造成慢性痛负性情绪模型。除正常组和模型组外,余下3组在立体定位仪上实施双边杏仁核埋管(Paxinos和watson大鼠脑图谱定位杏仁核(P2.5mm, L4.5mm, H7.7mm),双边分别微量注射生理盐水、阿片u受体拮抗剂(CTOP) (27μg/μL,0.25μL/次)GluAl拮抗剂(NASPM) (10μg/μL,0.25μL/次)。每次注射之后电针刺激双侧“足三里-阳陵泉”1mA,2/15Hz,每天1次,每次30分钟,共5天。电针结束后,测定大鼠双侧足底热辐射痛阈值,并取其健侧减患侧差值(PWLD),及疼痛负性情绪维度即大鼠在条件控制箱(CPA)停留时间。结果1、电针对慢性痛大鼠痛感觉和情绪成分行为反应的影响与正常组比较,模型组的PWLD显著增加(P<0.001),条件控制箱箱停留时间显著减少(P<0.001),与模型组相比,EA组或AEA组电针7天后PWLD均显著降低(P<0.05),EA组在条件控制箱停留时间显著增加(P<0.05), AEA组条件控制箱停留时间没有明显变化(P>0.05),电针干预后,动物痛阈增加同时NA减弱,麻醉电针则抑制了电针对NA的作用。2、电针对杏仁核内痛感觉和情绪成分相关兴奋性递质受体、抑制性递质受体、细胞内蛋白激酶表达变化的影响与正常组相比较,模型组杏仁核内MOR蛋白表达量显著增加(P<0.05), GluAl, Synaptophysin, p-ERK2, p-CREB的蛋白表达显著减少(均P<0.05)。电针7天后,EA组这5个蛋白,AEA组MOR, p-ERK2及p-CREB蛋白表达均明显上调(P<0.001、P<0.01、P<0.05),GluAl, Synaptophysin表达无明显变化(P>0.05)；与EA组比,AEA组MOR, p-ERK2, p-CREB的表达无明显差异(P>0.05), GluAl, Synaptophysin表达明显降低(P<0.05)。2、杏仁核内注射阿片u受体及GluAl拮抗剂验证阿片μ受体及GluAl在针刺对痛感觉和痛情绪中的作用造模后,PWLD值显著增加(P<0.001),电针2天各组未见明显变化(P>0.05),电针5天后,生理盐水组和GluAl拮抗剂组PWLD明显下降(P<0.01),而MOR拮抗剂CTOP组下降无显著性意义(P>0.05)。即说明杏仁核内注射盐水和谷氨酸GluAl受体阻断不影响电针的镇痛效应,而阻断MOR后,电针镇痛效应明显减弱。造模后,神经痛负性情绪大鼠在条件控制箱内停留时间显著缩短(P<0.001),电针2天、第5天,盐水组和MOR拮抗剂CTOP组的停留时间显著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.001),而GluAl拮抗剂NASPM组与模型组比较未见显著变化(P>0.05).说明杏仁核内注射生理盐水和MOR拮抗剂后,电针改善模型大鼠的负性情绪的效应仍然存在,而注射GluAl拮抗剂后,电针的上述效应消失。小结电针和麻醉电针均能改善神经痛负性情绪大鼠痛感觉成分,而只有电针改善了神经痛负性情绪大鼠痛情绪方面,麻醉下电针抑制了动物的情绪活动,也明显减弱了电针改善该模型大鼠负性情绪的效应。杏仁核内阿片μ受体,GluAl, Synaptophysin, ERK/CREB可能参与了这一过程,杏仁核介导的电针对痛感觉成分的作用可能与上调阿片μ受体有关,电针对痛情绪成分的作用可能与上调GluAl, Synaptophysin的表达相关。ERK2/CREB信号通路参与痛的感觉和情绪方面机制有待进一步探讨。p-ERKl各组没有明显差异。