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鸡球虫病是养鸡业中一种高发病率、极难防治的疾病之一,全世界每年因球虫病造成的经济损失超过70亿美元,仅我国每年用于防治鸡球虫病的药费就达20-30亿元人民币,占鸡病全部防治费用的近1/3。虽然抗球虫药物在球虫病防治中有着重要的作用。但由于球虫的生物学特性、家禽生产的特点以及食品安全问题,药物耐药性和药物残留等问题严重制约着养鸡业的正常发展,研究者们一直致力于球虫免疫方面的研究,力图通过免疫学手段来控制该病。目前用于临床的一些商品化球虫活苗,因具有潜在毒力“返强”的危险性,其生产安全性和使用范围严重受限。球虫基因工程苗研制方面也未见有重大突破,其可能原因与人们对球虫与机体相互作用的免疫机制,特别是机体识别球虫感染的固有免疫机理不清楚有关。上世纪90年代,Janeway等开启了固有免疫研究的新纪元,提出固有免疫细胞受体识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)理论。在该理论的指引下,人们发现并鉴定了哺乳动物和禽鸟类Toll样受体(Toll like receptors, TLRs),对传统的免疫学有了新的认识。TLRs是一类重要的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs),通过识别PAMP,启动机体的固有免疫和适应性免疫反应,在抗感染中起重要作用。本研究以分子固有免疫学为理论指导,分子生物学、细胞生物学和生物信息学为研究手段,以鸡艾美尔属球虫中致病力最强的柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella)为研究对象,对雏鸡不同组织中Toll样受体(Chicken Toll like receptor, ChTLR) mRNA表达水平进行研究,通过体内感染E. tenella、体外以E. tenella子孢子刺激固有免疫细胞,研究鸡重要的靶器官、免疫器官和固有免疫细胞ChTLRs mRNA表达情况,明确与E. tenella子孢子识别有关的ChTLRs类型。最后,利用RNAi对ChTLRs在识别E. tenella中的作用及信号通路进行研究。主要研究结果如下：1.鸡TLRs、信号传导分子和炎性细胞因子表达水平实时定量PCR检测方法的建立根据GenBank公布的鸡Toll样受体(ChTLRs)(ChTLR1、ChTLR2、ChTLR3、 ChTLR4、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21)、信号传导分子(MyD88、TRIF、TIRAP、TRAF6和NF-κB)和炎性细胞因子(IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-12)mRNA序列,以β-actin为内参基因,设计并合成相应基因的PCR扩增引物,建立检测ChTLRs.信号传导分子和炎性细胞因子mRNA表达水平的实时定量PCR方法。试验结果显示,所扩增的18个基因片段与相应基因的同源性在98%-100%之间；建立的实时定量PCR方法溶解曲线均呈单峰,其溶解温度在75.5℃～89.0℃之间；PCR扩增效率为95.5%～108.3%,相关系数为0.989～1.000,斜率为-3.137～-3.435；Ct值变异系数在0.47%～2.03%之间；检测敏感性达10-13g/mL。表明所建立的检测鸡TLRs、信号传导分子和炎性细胞因子相应目标基因表达水平的实时定量PCR方法特异性强、敏感性和重复性高,为后续试验研究提供技术支持。2.雏鸡不同组织器官ChTLRs、MyD88、TRIF和TIRAP表达图谱研究为确定体内试验研究靶样组织中ChTLRs、MyD88、TRIF和TIRAP mRNA表达情况,对10日龄罗曼雏鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、十二指肠、空肠、盲肠、肌肉和皮肤共12个组织中相应基因mRNA表达进行检测。结果发现,ChTLRs、MyD88、TRIF和TIRAP mRNA在各免疫器官和肠道组织中均有表达。其中,ChTLR、ChTLR15、MyD88、TIRAP mRNA在法氏囊表达水平最高,ChTLR2、ChTLR7、ChTLR21mRNA在脾脏表达水平最高,ChTLR3和ChTLR5mRNA在肾脏组织表达水平最高；ChTLR4和TRIF mRNA在十二指肠中表达水平最高,相对其他ChTLRs, ChTLR4mRNA在所检测组织中的表达水平差异较低。在一些组织器官中ChTLRs表达水平较低,甚至未检测到表达,如ChTLR5mRNA在心脏,ChTLR7mRNA在肝脏和皮肤,ChTLR15mRNA在肺脏和肾脏组织中表达水平极低；在肾脏、肺脏和皮肤组织中未检测到ChTLR2mRNA表达,在肺脏组织中未检测到ChTLR3mRNA表达。与各被检组织间ChTLRs mRNA表达水平差异性相比,各组织MyD88、TRIF和TIRAP mRNA表达差异不明显。总体表明,ChTLRs、MyD88、TRIF和TIRAP mRNA在雏鸡脾脏和盲肠组织中均有广泛表达。3.E. tenella体内感染鸡盲肠和脾脏ChTLRs、MyD88和TRIF表达动态变化为研究E. tenella体内感染鸡盲肠(靶器官)和脾脏(重要免疫器官)组织ChTLRs、MyD88和TRIF mRNA表达情况,对15日龄雏鸡每只经口接种50000个E. tenella孢子化卵囊,并设立不感染球虫对照组,检测感染E. tenella3h12h,24h和72h盲肠和脾脏组织中ChTLRs、MyD88和TRIF mRNA表达水平。结果显示,雏鸡感染球虫3h,除MyD88基因略有上调外,脾脏组织ChTLRs和TRIF mRNA表达水平均下调,盲肠组织仅ChTLR3和MyD88mRNA表达水平上调,其余ChTLRs和TRIF mRNA表达水平均下调,无显著性差异。感染球虫12h,脾脏组织ChTLR1和ChTLR4mRNA表达水平略有下调,脾脏和盲肠其他ChTLRs、MyD88和TRIF mRNA表达水平均上调,其中ChTLR3、ChTLR15和MyD88mRNA表达水平显著上调,以盲肠MyD88mRNA表达水平最高,为对照组的10.45倍。感染球虫24h,脾脏组织仅ChTLR3mRNA表达水平略高于对照组,其他ChTLRs、MyD88和TRIF mRNA表达水平均有所下调,盲肠组织仅ChTLR1、MyD88和TRIF mRNA表达水平高于对照组,所有ChTLRs mRNA表达水平均下调,无显著性差异。感染球虫72h,仅脾脏组织ChTLR7、MyD88、TRIF和盲肠组织MyD88mRNA表达水平略有上调,与对照组相比,差异不显著。4. E. tenella子孢子体外刺激鸡固有免疫细胞ChTLRs、MyD88、TRIF和炎性细胞因子表达水平研究利用E. tenella子孢子体外刺激鸡异嗜白细胞和巨噬细胞,研究两类固有免疫细胞ChTLRs、MyD88、TRIF和炎性细胞因子(IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-12)：mRNA表达情况。结果发现,与不刺激对照组相比,活的E. tenella子孢子刺激2h,异嗜白细胞和巨噬细胞ChTLR4和ChTLR15mRNA表达水平显著上调；刺激4h,异嗜白细胞ChTLR4mRNA表达维持在对照组水平,ChTLR15和IL-6mRNA表达水平显著增加。灭活的E. tenella子孢子比活子孢子能刺激异嗜白细胞和巨噬细胞产生更高水平的ChTLRs、信号传导分子和炎性细胞因子mRNA表达。E. tenella灭活子孢子刺激异嗜白细胞2h,ChTLR3、ChTLR4、ChTLR15、MyD88、IFN-y、IL-6、IL-10和IL-12mRNA表达水平显著增加；刺激4h,ChTLR4、ChTLR15、IFN-y、IL-6和IL-10mRNA表达水平显著上调。灭活的E. tenella子孢子刺激巨噬细胞2h,ChTLR4、ChTLR15、MyD88、IL-6、IL-12和IFN-y mRNA表达水平显著增加。提示ChTLR4和ChTLR15与识别E. tenella有关。5. ChTLR4和ChTLR15对E. tenella的识别及信号通路研究为进一步确认ChTLR4和ChTLR15对E. tenella的识别作用,利用RNAi技术分别和同时对ChTLR4和ChTLR15表达进行干涉,研究阻断ChTLR4和ChTLRl5基因表达对信号传导分子(MyD88、TIRAP、TRAF6和NF-κB)和炎性细胞因子(IFN-y、IL-6、IL-10和IL-12)mRNA表达水平及细胞培养上清中细胞因子含量的影响。同时,进一步干扰沉默MyD88mRNA表达,然后检测相应信号传导分子和炎性细胞因子mRNA表达水平及细胞培养上清中细胞因子的含量。结果显示,siChTLR4#1对巨噬细胞ChTLR4mRNA表达水平干涉效果达73.12%。干涉沉默ChTLR4mRNA表达后,MyD88、TIRAP、TRAF6.NF-κB、IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-12mRNA表达水平均下调,E. tenella子孢子刺激24h,巨噬细胞培养上清液中IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-12含量均降低,无显著性差异。siChTLR15#1对巨噬细胞ChTLR15mRNA表达水平干涉效果为69.68%。干涉沉默ChTLR15mRNA表达后,巨噬细胞MyD88、TIRAP、TRAF6、NF-κB、IFN-y、IL-6、IL-10和IL-12mRNA表达水平均下调,其中IL-12mRNA表达水平显著低于阴性转染刺激对照组,E. tenella子孢子刺激24h,巨噬细胞培养上清液中IL-12含量显著降低,IFN-γ、IL-6和IL-10含量也下降,无显著性差异。同时干涉沉默ChTLR4和ChTLR15mRNA表达,MyD88、TRAF6、IFN-γ和IL-12mRNA表达水平显著下降,E. tenella子孢子刺激24h,巨噬细胞培养上清液中IL-12的含量显著降低。siMyD88#1对巨噬细胞MyD88mRNA表达水平干涉效果达69.75%。干涉沉默MyD88mRNA表达后,TIRAP、TRAF6、NF-κB、IFN-γ和IL-12mRNA表达水平显著下调；细胞培养上清液中IL-12含量显著降低,IFN-γ、IL-6和IL-10含量也下降,无显著性差异。综上所述,本研究表明ChTLR4和ChTLR15作为重要的固有免疫PRRs参与对E. tenella的识别作用。证实ChTLR4和ChTLR15识别E. tenella子孢子后,固有免疫系统是以MyD88依赖途径进行免疫信号传导。同时发现,ChTLR15在识别E. tenella子孢子后介导巨噬细胞产生IL-12;ChTLR4对ChTLR15介导E. tenella子孢子刺激巨噬细胞产生IL-12和IFN-γ可能具有协同作用。