核糖体是一个巨大的分子机器,其能够将mRNA编码的信息翻译成细胞内行使功能的蛋白质。核糖体的组装是细胞活动中最耗能的活动之一。在酿酒酵母中,核糖体的合成需要很多组装因子,这些组装因子能够协调pre-rRNA的折叠和加工以及帮助核糖体蛋白的正确组装。核糖体的合成起始于核仁,在此一条完整的35S pre-rRNA被转录出来,随后经过剪接、加工以及运到细胞质中形成成熟的核糖体。组装的早期,数百个组装因子能够与pre-rRNA组装成一个沉降系数为90S的大的核糖体前体颗粒。理解这个90S核糖体前体的结构与组装是核糖体合成领域的一项艰巨的任务。本论文一共分为两个部分,第一部分我们将阐述核糖体90S前体中两个相互作用的蛋白亚复合物Krr1-Faf1的功能,第二部分我们发现了一个新的参与核糖体合成调节的因子Otu2。我们将结合结构与生化的分析来理解他们在核糖体合成过程中的功能。Krr1与Faf1是核糖体小亚基合成前体90S复合体中的两个相互作用的蛋白质。我们解析了 Krr1核心结构域与Faf1 一段多肽的复合物结构。Krr1的结构含有两个KH结构域,KH1和KH2。在酵母中,Krr1的结构与古细菌的Dim2样蛋白的结构非常相似。我们发现KHI结构域是一个退化的KH结构域,不具有GXXGmotif,同时其可能参与结合另外一个组装因子Kri1。KH2结构域则包含有一个经典的RNA结合表面,同时能够与Faf1的一段α螺旋结合。特异性的打破Krr1-Faf1的相互作用阻碍了早期90S pre-rRNA在A0、A1、A2位点的切割,同时也将导致细胞的死亡。但是打破这两个蛋白之间的相互作用并不影响其组装到90S前体中。因此,Krr1与Faf1的相互作用可能对于90S核糖体前体维持一个有功能的构象是至关重要的。综上,我们阐明了 KH结构域在参与蛋白质结合中的多变性并深入分析了两者之间的相互作用在核糖体合成过程中的作用。目前,参与酵母核糖体合成的很多必需因子都已经被鉴定出来。在本论文的第二部分,我们发现OUT家族的一个去泛素化酶Otu2可能是一个新的核糖体组装因子。Otu2缺失的酵母并不致死,但却表现出对一些核糖体翻译抑制剂的高敏感性。敲除Otu2后,40S小亚基、60S大亚基以及正在翻译的多聚核糖体含量都显著下降。这暗示Otu2参与了核糖体的合成或核糖体的降解过程。Otu2蛋白定位于细胞质中,蔗糖密度梯度离心实验表明Otu2是与核糖体相关的。通过蛋白质组学以及免疫共沉淀的分析,我们发现在核糖体前体中,Otu2能与很多核糖体相关的蛋白质共纯化。值得注意的是,pre-40S中的组装因子能够与Otu2共纯化出来,我们通过co-IP验证了体内Otu2确实与pre-40S的组装因子存在相互作用。这表明Otu2能够组装到pre-40S中并调节核糖体的生成。我们解析了Otu2蛋白质的催化核心结构域的结构,结构由两个球形的夹子组成,中间形成一个浅浅的裂缝。这个裂缝是高度保守的并参与结合泛素。根据OTUD5与泛素的复合物结构,我们可以模拟泛素与Otu2的结合。Otu2蛋白在人中有两个同源蛋白,一个是OTUB6A,一个是OTUD6B。OTUB6A对Lys27、Lys29、Lys33偶联形式的泛素链具有特异性的活性,而OTUD6B对所有泛素链都没有活性。Otu2的底物是未知的。在酵母或其他真核生物中,核糖体蛋白Rps31和Rp130是以融合泛素的形式表达的,Otu2能够组装到pre-40S中促使我们推测Otu2可能参与切割泛素-Rps31融合蛋白。体外实验表明对于泛素-Rps31融合蛋白,Otu2表现出非常微弱的去泛素化酶活性。体内敲除Otu2后,泛素-Rps31融合蛋白的加工并没有受到影响。这表明Otu2可能不参与泛素-Rps31融合蛋白的切割或者其并不是体内唯一切割泛素-Rps31的酶。我们的实验结果提供了 Otu2参与核糖体合成的初步线索,但是Otu2的真正底物及其在核糖体合成过程中的功能还需进一步的验证。