【摘 要】
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目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除斑马鱼faf1基因,并研究faf1基因对斑马鱼发育的影响。方法针对斑马鱼faf1基因设计并制备gRNA,通过显微注射技术将gRNA与Cas9 mRNA混合注
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目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除斑马鱼faf1基因,并研究faf1基因对斑马鱼发育的影响。方法针对斑马鱼faf1基因设计并制备gRNA,通过显微注射技术将gRNA与Cas9 mRNA混合注入斑马鱼单细胞胚胎中,酶切和基因测序技术筛选出发生突变的F0代斑马鱼,将其与野生型斑马鱼外交得到F1代杂合体,再将同种突变类型的F1代斑马鱼自交得到F2代纯合子斑马鱼,并用显微镜观察、记录每一代斑马鱼表型。结果成功制备了faf1 gRNA和Cas9 mRNA。位于faf1 6号外显子的gRNA6和4号外显子的gRNA7能使faf1基因发生移码突变。筛选出可遗传突变类型(mutant type 1,MU1)并观察到该杂合突变型斑马鱼有体细胞色素沉积延迟、4dpf(days post fertilization,dpf)开使尾部肌节出现“结节样”表型以及头颅缩小、舌骨小角角度增大等颅面软骨畸形的变化,并于受精后8~9dpf死亡。结论相对于以往文献报道中在斑马鱼中利用Morpholino(MO)敲低faf1基因产生颅面软骨变化的表型,本研究中利用CRISPR/Cas9敲除该基因产生了新的表型,即色素沉积延迟及尾部肌节部位出现“结节样”变化。为探究faf1基因功能奠定了基础,也为唇腭裂发病机制的研究提供了新线索。
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