论文部分内容阅读
研究背景和目的:视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,RB)是儿童中最常见的原发性恶性眼内癌,几乎全部见于儿童,患者的存活率非常的低,对患者的视力以及生命造成很大的威胁和危害,视网膜母细胞瘤己成为医患双方共同关注的重中之重。视网膜母细胞瘤主要发生于5岁以前的婴幼儿,临床发现视网膜母细胞瘤可单眼或双眼发病,患者常因瞳孔区发白或斜视来医院就诊,但此时出现视力下降、眼球突出、青光眼等才引起家长注意,此时已到晚期,治疗效果非常的差。目前研究发现其增殖是导致其治疗效果差的最主要原因。值得关注的是,微小RNA(micro-RNA)是一类长度为20-24个核苷酸的非编码单链小分子RNA,研究发现miRNA主要广泛分布于组织和细胞中,miRNAs的功能目前主要认为是参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖和分化等生命活动。最近大量的研究发现miRNAs与肿瘤的发生和发展密切相关。miRNA目前研究发现其下游的靶基因可能是抑癌基因,也可能是癌基因。目前值得关注的是miRNA-101-3p与肿瘤的关系十分密切。大量的研究发现miRNA-101-3p在口腔鳞状细胞癌、乳腺癌和肺癌等肿瘤研究中证实其表达下调,并过表达miRNA-101-3p能够抑制肿瘤细胞的增殖和凋亡,然而,miRNA-101-3p在视网膜母细胞瘤中的作用及相关机制研究尚未见报道。EZH2通过参与组蛋白甲基化并最终抑制转录。EZH2的甲基化活性促进异染色质形成,从而使基因功能沉默。有研究报道EZH2在促进癌前病变向癌症发生转化的进展中发挥着十分重要的作用。此外,越来越多的研究已经证实,EZH2的在肿瘤中的异常表达与恶性肿瘤的进展密切相关。大量的研究证实EZH2的高表达的可能对肿瘤细胞的增殖、侵袭转移、化疗敏感性等生物学特性有促进作用。然而,值得探讨和研究的是:EZH2在视网膜母细胞瘤中被调控的机制尚不清楚?乙酰化过程中关键酶HDACs家族在肿瘤的进展中发挥十分重要的作用。特别是,最新的研究表明,发现去乙酰化酶Ⅱ家族中的组蛋白去乙酰化酶HDAC9,HDAC9含有去乙酰化酶活性结构域,MEF2域,丝氨酸结合位点,锌脂结构域和核定位信号。有意思的是,近年来发现HDAC9在多种肿瘤中呈现高表达,肿瘤细胞的恶性往往和细胞增殖的改变密切相关,综上这些研究认为HDAC9在肿瘤细胞增殖乃至于发生发展过程中发挥着十分关键作用。另外一个值得探讨的问题是,HDAC9在视网膜母细胞瘤中表达情况以及HDAC9被调控的机制尚不清楚?本研究拟首先通过荧光定量PCR检测miRNA-101-3p表达在视网膜母细胞瘤中的表达情况;其次,明确miRNA-101-3p在视网膜母细胞瘤中的表达及其与临床病理特征的关联;进一步通过体内体外实验证实miRNA-101-3p对视网膜母细胞瘤增殖的影响,观察改变miRNA-101-3p的表达对视网膜母细胞瘤细胞增殖的影响以及动物实验证实miRNA-101-3p的表达对视网膜母细胞瘤细胞增殖影响。此外,本研究通过荧光素酶报告基因分析验证EZH2和HDAC9是否是miRNA-101-3p的下游靶基因,首先通过改变EZH2和HDAC9蛋白在视网膜母细胞瘤中的表达,验证其对视网膜母细胞瘤细胞增殖能力的影响。然后在过表达miRNA-101-3p的视网膜母细胞瘤细胞中干扰EZH2和HDAC9的表达,观察视网膜母细胞瘤细胞增殖能力的变化。从而明确mi RNA-101-3p及EZH2和HDAC9对视网膜母细胞瘤细胞增殖能力的影响。方法:1、通过运用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测我院2016年1月至2018年1月行手术切除的视网膜母细胞瘤组织中miRNA-101-3p的表达水平,统计分析实验结果。2、利用CCK8和流式等实验观察视网膜母细胞瘤增殖能力的改变;将稳定转染miRNA-101-3p mimics的视网膜母细胞瘤细胞株和未转染的视网膜母细胞瘤细胞株建成裸鼠皮下人视网膜母细胞瘤模型,观察荷瘤鼠皮下肿瘤的生长变化;3、通过荧光素酶报告基因等实验方法进一步探讨EZH2和HDAC9是否是miRNA-101-3p的特异性的下游靶的基因,并将构建好的miRNA-101-3p mimics和miRNA-101-3p negative control(NC)通过转染试剂转让至视网膜母细胞瘤细胞中,改变miRNA-101-3p的表达情况,从而通过qPCR和western blot检测EZH2和HDAC9 mRNA及蛋白的表达情况的变化。4、在过表达视网膜母细胞瘤细胞中miRNA-101-3p的表达,分别转染EZH2和HDAC9过表达质粒,利用CCK8实验观察视网膜母细胞瘤增殖能力的改变。结果:1.较正常组织,miRNA-101-3p在视网膜母细胞瘤中呈现低表达;2.将miRNA-101-3p mimics转染到视网膜母细胞瘤WERI-RB-1细胞和Y79细胞中,视网膜母细胞瘤细胞的增殖显著降低(p<0.05);通过裸鼠成瘤实验发现miRNA-101-3p mimics转染视网膜母细胞瘤细胞,我们结果发现过表达miRNA-101-3p组的裸鼠皮下肿瘤比空白质粒对照组的视网膜母细胞瘤细胞形成的皮下肿瘤在体积和重量方面都显著出现了降低(p<0.05)。3.我们通过生物信息学分析发现EZH2和HDAC9是mi RNA-101-3p潜在的靶基因。进一步荧光素酶报告基因证实EZH2和HDAC9是miRNA-101-3p下游靶基因。此外,在视网膜母细胞瘤WERI-RB-1细胞和Y79细胞中转染miRNA-101-3p mimics,EZH2和HDAC9的mRNA和蛋白表达均下降。4.在过表达miRNA-101-3p的视网膜母细胞瘤WERI-RB-1细胞和Y79细胞中的表达,分别转染EZH2和HDAC9过表达质粒,CCK8实验观察发现分别过表达EZH2和HDAC9可逆转miRNA-101-3p抑制的视网膜母细胞瘤的增殖。结论:miRNA-101-3p在视网膜母细胞瘤组织中低表达,miRNA-101-3p通过靶向抑制EZH2和HDAC9表达从而抑制视网膜母细胞瘤的增殖,其具体的机制是EZH2和HDAC9是miRNA-101-3p的靶基因。