癫痫(Epilepsy,EP)是儿童时期常见的慢性神经系统疾病之一,我国儿童癫痫发病率为每年151/10万,患病率约为3.45‰。发育期长期反复癫痫发作能够造成认知缺陷、情感障碍及行为异常,给个人、家庭和社会均造成负担。目前,癫痫的治疗以抗痫药物(antiepileptic drugs,AEDs)为主,辅助手术治疗。传统抗癫痫药物虽有一定疗效,但毒副作用较大,特别是认知功能损伤和行为障碍。而手术治疗癫痫不但适应症较局限而且具有一定风险性。因此,从癫痫发生机制入手,寻找抗癫痫新途径,以最小的副作用达到治疗癫痫的目的,成为国内外儿科癫痫治疗上的研究热点。癫痫的病理过程十分复杂,启动了多个细胞生物学过程,其中包括细胞自噬。自噬对于维持胞内稳态、应对应激状态非常重要,与多种人类疾病密切相关。通过自噬途径降解细胞内损伤或多余线粒体称作线粒体自噬,损伤线粒体的清除有助于细胞存活,研究表明神经元损伤过程中伴随线粒体自噬的激活。载脂蛋白J,即丛生蛋白clusterin的神经保护作用近年来已被广泛认可,但其机制尚未完全明确。clusterin具有抗凋亡的功能,这种凋亡是线粒体主导的,近来研究又发现clusterin的这种抗凋亡作用与自噬的激活关系密切。我们课题组前期研究发现clusterin在惊厥过程中高表达,且与自噬相关蛋白表达密切相关。以上这些启发了我们研究惊厥过程中clusterin与线粒体白噬的关系及其可能的作用。因此,本课题旨在明确clusterin在惊厥脑损伤过程中的作用,探讨其与线粒体自噬的关系及其在线粒体自噬中作用,阐明调控机制,并探讨其作为惊厥治疗靶点的可能性。第一部分 发育期惊厥致clusterin高表达并上调NIX介导的线粒体自噬目的:明确clusterin及线粒体自噬蛋白在惊厥模型中的表达规律,分析其相关性,并初步明确clusterin在线粒体自噬及神经元存活中的作用。方法:(1)取日龄21天(Postnatal days 21,P21)的ICR小鼠,依据随机数字表法随机分为对照组和惊厥组。适应性喂养1天后,于P22天,惊厥组腹腔注射海人酸诱导惊厥发作;对照组注射生理盐水。确认造模成功后24h取海马组织提取线粒体蛋白,运用免疫印迹(western blot,WB)方法,检测clusterin及线粒体自噬蛋白的表达,并对惊厥组中clusterin与线粒体自噬蛋白表达进行相关性分析。在此基础上取P21天小鼠同上方法制作海人酸惊厥模型,取60只制模成功的小鼠作为惊厥组,同时取60只小鼠注射生理盐水作为对照组。分别在惊厥后6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d、21d、28d不同时间点取海马组织(每个时间点每组6只),运用RT-PCR方法检测各时间点clusterin及NIX基因的表达,并运用免疫印迹(western blot,WB)方法,检测clusterin及线粒体自噬蛋白NIX、LC3的表达,分析其表达规律和趋势。采用原位免疫荧光染色法,原位检测clusterin、NIX及LC3在海马中的表达并进行分析。(2)为进一步验证以上结果,我们培养原代海马神经元细胞。首先在培养7天的细胞中制作谷氨酸损伤模型,分谷氨酸组和对照组,谷氨酸组加入谷氨酸使其终浓度为50μM,对照组加入相应体积培养基。6h后运用细胞免疫荧光检测检测clusterin、NIX、LC3的表达和分布。为探明clusterin是否在NIX介导的线粒体自噬中起作用,我们利用原代神经元细胞制作谷氨酸损伤模型,并加入外源clusterin进行干预(谷氨酸损伤+clusterin干预模型)。分正常对照组(control组)、单纯clusterin对照组(CLU组)、单纯谷氨酸组(Glu组)及谷氨酸+clusterin干预组(Glu+CLU组)。control组加入对应单纯体积培养基;CLU组加入clusterin,终浓度为100ng/ml;Glu组加入谷氨酸,终浓度为100μM;Glu+CLU组在加入谷氨酸前2h加入clusterin(终浓度分别是100ng/ml和 100μM)。分别在加入谷氨酸后 1.5h、3h、6h、12h、18h、24h、36h、48h收集细胞。RT-PCR方法检测clusterin、NIX基因的表达,WB检测clusterin、NIX、LC3在线粒体中的表达规律。在上述模型6h这个时间点中,运用线粒体自噬检测试剂盒检测clusterin对线粒体自噬的影响。利用CCK8和LDH检测clusterin对神经元细胞存活的影响。结果:(1)24小时惊厥模型结果显示:与正常对照组比较,惊厥组海马组织中clusterin表达显著上调,自噬相关蛋白NIX、LC3II/I、PINK1、Parkin表达均上调,NIX及LC3II/I上调显著,分析惊厥组线粒体中clusterin、NIX、LC31I/1表达的相关性,结果显示三者呈正相关。(2)RT-PCR结果显示:正常组海马组织在不同时间clusterin和NIX的基因mRNA水平表达基本无变化;惊厥后海马组织中clusterin、NIX的基因表达均显著上调,且具有表达规律,均在惊厥后6小时出现高峰,并且在惊厥后5d恢复至正常水平。在惊厥后14d、21d、28d,clusterin mRNA的表达低于正常对照组,差异具有统计学意义;惊厥后期(7d、14d、21d、28d)NIX mRNA的表达与正常对照组比较,差异无统计学意义。(3)WB结果显示正常组海马组织线粒体中clusterin、NIX、LC3II/I的表达在不同时间的表达基本无变化,惊厥后海马组织线粒体中clusterin、NIX、LC3I1/I的表达均显著上调,且具有表达规律,均在惊厥后12小时出现高峰,clusterin和LC3LC3II/I在惊厥后10d恢复至正常水平,NIX在惊厥后7d恢复至正常水平;惊厥后21d、28d,clusterin蛋白的表达低于正常对照组,差异具有统计学意义;(4)原位免疫荧光分析显示:与正常组对照比较,clusterin与NIX及LC3在惊厥组海马中的表达显著上调,且呈现共表达。(5)原代神经元谷氨酸损伤模型免疫荧光显示:clusterin与NIX及LC3在谷氨酸组细胞中高表达,表达部位一致。(6)原代神经元谷氨酸损伤+clusterin干预模型中PCR结果显示:control组和CLU组中clusterin、NIX的基因在各时间段的表达均无变化;Glu组中clusterin与NIX的表达高峰出现在3h这个时间点,Glu+CLU组中,clusterin与NIX的表达高峰仍然出现在3h这个时间点,与Glu组中无差异,并且两组均在9h后开始回落。(7)原代神经元细胞谷氨酸损伤+clusterin干预模型中WB结果显示:control组和CLU组中clusterin、NIX及LC3的蛋白在各时间段的表达均无变化;Glu组中clusterin与NIX、LC3的表达高峰出现在6h这个时间点,Glu+CLU组中,clusterin与NIX、LC3的表达高峰出现在3h这个时间点,比单纯谷氨酸损伤组早出现。(8)在原代神经元细胞谷氨酸损伤+clusterin干预模型中线粒体自噬检测显示,与control组比较,Glu组中线粒体自噬水平显著上调,而Glu+CLU组中外源clusterin的加入能进一步提高细胞线粒体自噬水平。(9)CCK8及LDH结果显示:与Glu组比较,Glu+CLU组能显著提高细胞的存活率,CLU组与control组比较无明显变化。结论:(1)惊厥后线粒体上自噬相关蛋白表达上调,且NIX、LC3II/I与clusterin的表达呈正相关,提示clusterin可能与NIX介导的线粒体自噬关系密切。(2)惊厥后clusterin和NIX基因表达及线粒体中NIX、LC3II/I与clusterin蛋白表达在时空上表达规律基本一致。(3)外源clusterin的加入能使线粒体上NIX及LC3的表达时间高峰前移,但不影响clusterin及NIX基因水平的表达变化。(4)谷氨酸损伤模型中,clusterin干预能明显上调细胞中线粒体自噬水平。(5)谷氨酸损伤模型中,clusterin干预能提高神经元细胞的存活。第二部分 clusterin调控NIX介导的线粒体自噬抑制神经元损伤的机制目的:明确clusterin调控NIX介导的线粒体自噬发挥神经保护作用的机制。方法:(1)利用小鼠神经元细胞株HT22制作谷氨酸损伤模型,分正常对照组(control组)、单纯clusterin对照组(CLU组)、单纯谷氨酸组(Glu组)及谷氨酸+clusterin干预组(Glu+CLU组)。control组加入对应体积培养基;Glu组加入1μg/ml,终浓度为1μg/ml;Glu组加入谷氨酸,终浓度为5mM;Glu+CLU组在加入谷氨酸前2h加入clusterin,终浓度分别是1μg/ml和5mM。谷氨酸作用6h后利用线粒体自噬检测试剂盒检测各组线粒体自噬水平。并运用western blot检测各组线粒体中clusterin、NIX及LC3的表达变化。运用Real time PCR检测各组线粒体DNA编码基因,并用Nd2/GAPDH之比表征单位细胞/组织内的线粒体数量。运用线粒体红绿探针染色,并用流式细胞仪检测两者在各组细胞中的表达情况,用红(活性线粒体着色)/绿(所有线粒体着色)比率表示细胞中活性线粒体的比率(线粒体整体质量指标)。CCK8和LDH分析各组细胞存活情况。运用凋亡检测试剂盒流式检测上述各组细胞的凋亡。(2)进一步利用慢病毒载体构建clusterin过表达及沉默的稳定细胞株从正反两方面验证以上结果。各自分3组制作谷氨酸损伤模型(谷氨酸终浓度为5mM),分别是:正常细胞+谷氨酸组(N+Glu组)、空载病毒+谷氨酸组(C+Glu组)、clusterin病毒+谷氨酸组(CLU+Glu);正常细胞+谷氨酸组(N+Glu组)、空载病毒+谷氨酸组(siC+Glu组)、沉默clusterin病毒+谷氨酸组(siCLU+Glu组)。谷氨酸作用6h后,线粒体自噬检测试剂盒检测各组细胞内线粒体自噬水平。WB检测线粒体中clusterin、NIX及LC3的表达;(3)在此基础上,利用线粒体自噬抑制剂mdivi-1检测clusterin的促细胞存活作用是否通过线粒体自噬途径实现的,细胞分四组:谷氨酸组(Glu组)、谷氨酸+clusterin组(Glu+CLU 组)、谷氨酸+mdivi-1(Glu+mdivi-1组)、谷氨酸+clusterin+mdivi-1 组(Glu+CLU+mdivi-1组)(预先加入线粒体自噬抑制剂mdivi-1),CCK8和LDH检测各组细胞存活率;(4)利用慢病毒载体构建NIX沉默稳定细胞株,制作谷氨酸损伤模型,并加入clusterin进行干预,以此检测clusterin是否通过NIX影响线粒体自噬水平。细胞分四组:空载病毒+谷氨酸组(siC+Glu组)、空载病毒+谷氨酸+clusterin组(siC+Glu+CLU组)、沉默NIX病毒+谷氨酸组(siNIX+Glu组)、沉默NIX病毒+谷氨酸组+clusterin组(siNIX+Glu+CLU组)。WB检测各组线粒体中clusterin、NIX及LC3的表达;线粒体自噬检测试剂盒检测各组线粒体自噬水平。(5)利用过表达clusterin细胞株制作谷氨酸损伤模型,并通过免疫共沉淀实验检测clusterin与NIX、LC3是否相互作用。利用细胞免疫共定位检测clusterin对NIX、LC3与线粒体结合能力的影响,同上方法(1)中分四组:正常对照组(control)、单纯clusterin对照组(CLU)、单纯谷氨酸组(Glu)及谷氨酸+clusterin干预组(Glu+CLU组)。利用免疫双荧光标记法分别检测各组中NIX与线粒体、LC3与线粒体结合情况。结果:(1)线粒体自噬检测显示与control组比较,CLU组中线粒体自噬无明显改变,而Glu组和Glu+CLU组中,线粒体自噬显著上调;与Glu组比较,Glu+CLU组中线粒体自噬水平进一步上调。(2)Real time PCR结果表明,control组和CLU组中mtDNA表达差异无统计学意义;与control组比较,Glu组和Glu+CLU组中mtDNA的表达显著下调;与Glu组比较,Glu+CLU组中mtDNA进一步下调。(3)线粒体探针染色后流式细胞仪分析结果表明,与control组比较,Glu组和Glu+CLU组中线粒体红/绿比率上调显著下降;与Glu组比较,Glu+CLU组中红/绿比率则显著上调,而control组与CLU组中差异无统计学意义,提示clusterin能降低谷氨酸模型中线粒体的损伤。(4)CCK8及LDH结果显示,与control组比较,谷氨酸使细胞LDH释放量显示上调,而存活率则显著降低;与Glu组比较,Glu+CLU组中clusterin能降低LDH的释放量并提高细胞的存活,control组与CLU组中差异无统计学意义。(5)与N组相比,利用过表达clusterin细胞株制作谷氨酸损伤模型后,即CLU+Glu组中线粒体上NIX和LC3II表达增加,并提高线粒体自噬水平;与N组相比,利用沉默clusterin细胞株制作谷氨酸损伤模型后,即siCLU+Glu组中线粒体上NIX和LC3II表达则显著下降,并降低线粒体自噬水平。(6)CCK8和LDH结果显示,线粒体自噬抑制剂mdivi-1能显著逆转clusterin的促细胞存活的作用,提示clusterin可通过线粒体自噬水平影响细胞的存活。(7)沉默NIX表达能逆转clusterin促线粒体自噬水平升高的作用,细胞整体线粒体自噬水平显著降低,并且能明显降低线粒体膜上LC3的表达。(8)免疫共沉淀结果显示,clusterin与NIX及LC3能相互结合,clusterin与后两者可能存在相互作用位点。(9)细胞免疫荧光共定位显示,与Glu组比较,Glu+CLU组中NIX及LC3在线粒体周围聚集量增多。结论:(1)在谷氨酸损伤作用下,clusterin干预可通过上调NIX介导的线粒体自噬提高神经元细胞的存活。(2)clusterin可与NIX及LC3相互作用,并通过影响两者在线粒体上的结合进而调节线粒体自噬水平。第三部分 Clusterin早期干预可通过NIX介导的线粒体自噬发挥抗发育期惊厥所致脑损伤作用目的:上述研究表明clusterin能促进线粒体自噬发生并抑制神经元损伤,此部分实验在动物模型中验证clusterin抗惊厥所致脑损伤作用,为其能成为潜在的神经损伤治疗提供依据。方法:(1)选取新生7天的ICR幼鼠随机分三组进行侧脑室注射,分别是:假手术组(Sham)、病毒对照组(AAVctrl+KA)、clusterin 病毒组(AAVclu+KA)。Sham 组选择人工脑脊液进行注射,后期不做任何处理;AAVctrl+KA组选择腺相关病毒空载体进行注射,AAVclu+KA组选择过表达clusterin的腺相关病毒进行注射,后两者在侧脑室注射两周后腹腔注射海人酸制作惊厥模型。分别于制膜后6h、12h、1d、3d、7d、14d、28d取海马,RT-PCR检测clusterin和NIX的基因表达,western blot方法检测clusterin、NIX、LC3在线粒体上的表达。取12小时小鼠脑组织固定切片后进行免疫荧光组化,检测clusterin对NIX与LC3结合的影响。取28d的小鼠全脑固定脱水,冰冻切片,进行尼氏染色和Timm染色检测。(2)惊厥后7d,14d,21d运用爬杆实验、悬挂实验,检测小鼠神经反射能力,与惊厥后24d、25d运用旷场实验检测clusterin干预对小鼠惊厥后认知情绪功能的影响。惊厥后22d,23d进行Y迷宫、惊厥后26-28d进行暗箱实验检测clusterin是否能改善惊厥后记忆及认知受损程度。结果:(1)RT-PCR结果显示:Sham组中clusterin和NIX基因表达在各时间点基本无改变,AAVctrl+KA组和AAVclu+KA组中clusterin、NIX的表达高峰出现在惊厥后6h。AAVctrl+KA组及AAVclu+KA组中两个基因的表达均较Sham组高,但AAVclu+KA组较AAVctrl+KA组整体表达水平上调。(2)Sham组中clusterin、NIX、LC3在线粒体中的表达在各时间点无明显变化,AAVclu+KA组海马组织中线粒体上NIX、LC3的表达高峰出现在制模后6h,而AAVctrl+KA组则在12小时出现高峰,clusterin提早了 NIX和LC3在线粒体膜上的表达,且每个时间点的表达均比AAVctrl+KA组和Sham组高。(3)clusterin提高LC3与NIX的结合。提示clusterin可能具有促进LC3与NIX结合进而促进线粒体自噬的作用。(4)尼氏染色结果显示:clusterin能降低神经元丢失。(5)TIMM染色显示:clusterin能改善CA3和DG区神经元发芽。(6)与AAVctrl+KA组相比,AAVclu+KA组小鼠的前肢悬挂时间明显延长,但爬杆实验中两者无明显区别。(7)Y迷宫显示:与AAVctrl+KA组比较,AAVclu+KA组进入食物臂的次数和时间显著增加;(8)旷场实验显示,与AAVctrl+KA组比较,AAVclu+KA组能明显缩短延迟时间,增加开场得分。(9)与AAVctrl+KA组比较,AAVclu+KA组进入暗箱的次数和时间明显减少。结论:(1)clusterin能提早并提高NIX及LC3在线粒体上的表达,并能促进NIX与LC3的结合,促进线粒体自噬的发生。(2)clusterin对新生期惊厥性脑损伤致远期神经元脱失、苔藓纤维发芽、神经行为、认知等有干预作用,即clusterin干预可抑制神经元脱失、海马苔藓纤维异常发芽并减轻远期神经行为、认知的损伤。