背景和目的先天性肾积水是小儿外科常见畸形,约占新生儿的1%-2%,是儿童终末型肾功能衰竭的重要原因。肾盂输尿管连接部梗阻(ureteropelvic junction obstruction, UPJO)是导致新生儿非生理性肾积水最常见的原因,约占儿童肾积水的10%,而且梗阻大部分为先天性不完全梗阻。尿液浓缩能力下降是积水肾脏早期的功能变化。积水肾脏尿液浓缩和排泄功能变化的分子生物学机制目前仍不完全清楚。Agre和其同事在90年代发现水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)后,肾脏浓缩功能机理研究在分子水平上获得了重大进展。目前发现的13种水通道蛋白中分布于肾脏的有7种,主要分布在肾小球、近端小管、集合管和髓袢降支。其中现已明确AQP1-4是肾脏重吸收水浓缩尿液,从而维持机体水平衡的主要分子基础。为进一步揭示生理状态体液代谢平衡和病理状态下体液紊乱机制和寻找治疗及预防措施提供了较大帮助。研究表明,AQP1主要表达在肾单位的近端小管和髓袢下降支细段上皮细胞的顶质膜,而基侧膜则表达较少。AQP2是肾集合管柱状上皮细胞内最重要的水通道蛋白,是迄今为止所发现的唯一在细胞内分布受激素调控的水通道蛋白。AQP3位于集合管主细胞的基底膜和两侧膜上,在连接管也有大量的AQP3分布,AQP3既受加压素的调节,也受醛固酮调节。AQP4主要位于大鼠肾脏内髓集合管基底侧质膜上,可能参与集合管水分重吸收和尿液浓缩,但在近端小管S3节段基底侧质膜上也有表达。动物研究显示积水肾脏尿液浓缩及稀释功能的变化与AQPs的表达异常有关。双侧输尿管梗阻24h显著影响肾脏AQP1在近端小管和AQP2-4在集合管的表达,使其表达明显下调。该变化可能对双侧输尿管梗阻后水分重吸收障碍并引发低渗性多尿的病理生理过程起重要作用。单侧输尿管梗阻24h也可造成肾脏AQP1-4表达下调。AQPs的表达下降可能对单侧梗阻后水分重吸收障碍并引发低渗性多尿的病理生理过程起重要作用。上述研究结果均来自动物实验。目前,国内外文献对人类积水肾脏中AQP1-4的研究至今未见报道。对儿童积水肾脏中AQP1-4的研究无疑将有助于揭示小儿肾积水浓缩稀释功能变化的机制。有关AQP1-4 mRNA和蛋白表达与UPJO患儿积水肾脏超声形态、排泄功能、病理组织学改变和肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR)之间关系尚不清楚,而了解这些是临床医生面临的重要课题。因此本研究目的为：①观察人类先天性积水肾脏中AQP1-4 mRNA和蛋白的表达与B超分类和静脉肾盂造影分类不同积水程度之间的关系；②观察不同病理组织学改变的小儿先天性积水肾脏组织中AQP1-4 mRNA和蛋白的表达情况；③观察先天性积水肾脏中AQP1-4蛋白的表达与肾实质厚度变化和肾小球滤过率变化之间的关系。1.收集22例接受肾盂成形术和肾造瘘术,经手术后病理证实的先天性UPJO肾脏标本(男15例,女7例,年龄58.9±54.3月)。病变部位均为单侧,其中右侧15例,左侧7例。正常肾脏组织8例(男5例,女3例,年龄58.0±37.7月)来自小儿外科行肾切除术的经手术后病理证实的肾母细胞瘤癌旁的正常肾组织。2.按照国际胎儿协会制定的根据肾实质厚度和肾盂肾盏扩张超声表现的分级标准将上述患儿分为Ⅲ级肾积水(轻度肾积水组)和Ⅳ级肾积水(重度肾积水组)。其中Ⅲ级肾积水8例,Ⅳ级肾积水14例。3.按照静脉肾盂造影(Intravenous Pyelography, IVP)显影时间的长短将上述患儿分为两组。轻度肾积水组(10例；IVP 60min内肾盂肾盏显影)和重度肾积水组(12例；IVP 60min内肾盂肾盏不显影)。4.利用免疫组织化学技术检测所有积水肾脏和正常肾脏标本中AQP 1-4在正常肾脏和积水肾脏中的表达与定位。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测AQP1-4 mRNA在所有积水肾脏和正常肾脏标本中的表达水平。蛋白免疫印迹法(Western Blot)分别检测AQP1-4蛋白在所有积水肾脏和正常肾脏标本中的表达水平。5.统计学处理：应用SPSS 13.0 for windows统计软件包进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差表示；所有数值均近似正态分布,两组均数之间的比较用独立样本的t检验(t-test),三组及三组以上均数的比较用单因素方差分析(ANOVA)。检验水准为P=0.05。结果1.免疫组织化学检测结果显示：AQP1阳性着色主要分布在肾近曲小管的上皮细胞和髓袢降支细段上皮细胞胞质,以及肾小球毛细血管内皮细胞胞质。AQP2阳性着色主要分布在肾集合管主细胞胞膜和胞质。AQP3阳性着色主要分布在肾集合管主细胞基底侧膜。AQP4阳性着色主要分布在肾内髓集合管主细胞基底侧膜。与正常肾脏组织中AQP1-4的表达强度相比,积水程度越重的肾脏组织中AQPl-4的阳性表达强度越弱。2.RT-PCR结果显示B超分类肾积水的重度肾积水组中AQP1-4 mRNA的相对表达量明显低于轻度肾积水组和正常肾脏组(AQP1：0.237±0.154 Vs.0.624±0.084 Vs.0.858±0.122；AQP2：0.283±0.124 Vs.0.583±0.112 Vs.0.976±0.134;AQP3：0.460±0.146 Vs.0.760±0.066 Vs.1.006±0.084；AQP4：0.196±0.124 Vs.0.439±0.076 Vs.0.739±0.201；P<0.01)。RT-PCR结果显示IVP分类肾积水的重度肾积水组中AQP1-4 mRNA的相对表达量明显低于轻度肾积水组和正常肾脏组(AQP 1：0.194±0.118 Vs.0.598±0.092 Vs.0.858±0.122；AQP2：0.247±0.089 Vs.0.566±0.105 Vs.0.976±0.134；AQP3：0.426±0.126 Vs.0.741±0.074 Vs.1.006±0.084；AQP4：0.171±0.115 Vs.0.420±0.081 Vs.0.739±0.201;P<0.01)。3.Western Blot结果显示B超分类肾积水的重度肾积水组中AQP1-4蛋白的相对表达量明显低于轻度肾积水组和正常肾脏组(AQP1：0.349±0.096 Vs.0.705±0.059 Vs.0.895±0.040；AQP2：0.242±0.113 Vs.0.609±0.037 Vs.0.868±0.084；AQP3：0.195±0.133 Vs.0.575±0.050 Vs.0.806±0.076；AQP4：0.241±0.067 Vs.0.598±0.074 Vs.0.809±0.079；P<0.01)。Western Blot结果显示IVP分类肾积水的重度肾积水组中AQP1-4蛋白的相对表达量明显低于轻度肾积水组和正常肾脏组(AQP 1：0.343±0.099 Vs.0.692±0.062 Vs.0.895±0.040；AQP2：0.217±0.126 Vs.0.567±0.069 Vs.0.868±0.084；AQP3：0.171±0.127 Vs.0.543±0.082 Vs.0.806±0.076；AQP4：0.225±0.063 Vs.0.537±0.078 Vs.0.809±0.079；P<0.01)。1.收集26例接受肾盂成形术和肾造瘘术,经手术后病理证实的先天性UPJO肾脏标本(男17例,女9例,年龄55.9±49.5月)。病变部位均为单侧,其中右侧15例,左侧11例。正常肾脏组织10例(男6例,女4例,年龄63.7±36.8月)来自小儿外科行肾切除术的经手术后病理证实的肾母细胞瘤癌旁的正常肾组织。2.将上述患儿根据其积水肾脏的病理组织学变化将其分为病理学分级Ⅱ-Ⅲ级组,即轻度肾积水组(12例),和病理学分级Ⅳ-Ⅴ级组,即重度肾积水组(14例)。3.利用免疫组织化学技术检测所有积水肾脏和正常肾脏标本中AQP1-4在正常肾脏和积水肾脏中的表达与定位。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测AQP1-4 mRNA在所有积水肾脏和正常肾脏标本中的表达水平。蛋白免疫印迹法(Western Blot)分别检测AQP1-4蛋白在所有积水肾脏和正常肾脏标本中的表达水平。4.统计学处理：应用SPSS 13.0 for windows统计软件包进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差表示；所有数值均近似正态分布,两组均数之间的比较用独立样本的t检验(t-test),三组及三组以上均数的比较用单因素方差分析(ANOVA)。检验水准为P=0.05。结果1.免疫组织化学检测结果显示与第一部分中AQP1-4的免疫组化检测结果保持一致。2.RT-PCR结果显示病理学分级Ⅳ-Ⅴ级组,即重度肾积水组中AQP1-4mRNA的相对表达量明显低于轻度肾积水组和正常肾脏组(AQP1：0.154±0.12 Vs.0.618±0.10 Vs.0.858±0.12；AQP2：0.229±0.11 Vs.0.535±0.12 Vs.0.946±0.14；AQP3：0.402±0.15 Vs.0.7244±0.08 Vs.0.978±0.10;AQP4：0.169±0.11 Vs.0.423±0.08 Vs.0.756±0.18;P<0.01)。3.Western Blot结果显示病理学分级Ⅳ-Ⅴ级组,即重度肾积水组中AQP1-4蛋白的相对表达量明显低于轻度肾积水组和正常肾脏组(AQP1：0.335±0.096 Vs.0.697±0.057 Vs.0.878±0.051;AQP2：0.195±0.133 Vs.0.569±0.069 Vs.0.816±0.072；AQP3：0.229±0.104 Vs.0.553±0.089 Vs.0.797±0.081;AQP4：0.241±0.067 Vs.0.528±0.084 Vs.0.833±0.104；P<0.01)。材料与方法1.收集10例接受肾盂成形术和肾造瘘术,经手术后病理证实的先天性UPJO肾脏标本(男6例,女4例,年龄62.3±18.3月)。病变部位均为左侧。正常肾脏组织6例(男4例,女2例,年龄62.7±17.1月)来自郑州大学第一附属医院小儿外科行肾切除术的经手术后病理证实的肾母细胞瘤癌旁的正常肾组织。2.10例患儿均接受B超检测来验证肾实质厚度,同时接受核素99mTc-DTPA肾动态显像对患侧肾脏GFR进行评估。手术过程中对肾积水程度进行再次评估,重点观察肾实质厚度。3.利用蛋白免疫印迹法(Western Blot)分别检测AQP1-4蛋白在所有积水肾脏和正常肾脏标本中的表达水平。4.统计学处理：应用SPSS 13.0 for windows统计软件包进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差表示；所有数值均近似正态分布,两组均数之间的比较用独立样本的t检验(t-test)。积水肾脏中AQP1-4蛋白的相对表达量与99mTc-DTPA测定的GFR,以及积水肾脏肾实质厚度之间进行Pearson相关分析检验是否具有相关性,r值为Pearson相关系数。双侧P<0.05时认为有显著性差异。结果1.Western Blot结果显示正常肾脏组织中AQP1-4蛋白相对表达量分别为0.744±0.21、0.844±0.19、0.82±0.20和0.82±0.14,先天性积水肾脏组织中AQP1-4的相对表达量分别为0.40±0.14、0.48±0.18、0.47±0.21和0.55±0.22。正常肾组织中AQP1-4蛋白相对表达均明显高于肾积水组(P<0.05)。2.先天性肾积水患儿术前测量患侧肾脏肾实质厚度为1.8-8.5mm,平均为4.59±2.25mm。99mTc-DTPA测定患儿患侧肾脏GFR为24.01-56.65ml/min,平均为39.93±11.52ml/min。对侧肾脏GFR为84.08-118.09ml/min,平均为105.36±20.38ml/min。患侧肾脏GFR较对侧肾脏明显下降(P<0.05)。3.积水肾脏中AQP1-4蛋白相对表达量与积水侧肾脏肾实质厚度之间的相关性分析结果显示AQP1-4蛋白相对表达量与积水侧肾脏肾实质厚度之间的相关性系数r分别为0.754、0.724、0.726和0.716。P值分别为0.012、0.018、0.017和0.02,均<0.05,说明积水肾脏中AQP1-4蛋白相对表达量与肾实质厚度之间呈正相关。积水肾脏中AQP1-4蛋白相对表达量与积水侧肾脏GFR之间的相关性分析结果显示AQP1-4蛋白相对表达量与积水侧肾脏GFR之间的相关性系数r分别为0.690、0.705、0.691和0.750。P值分别为0.027、0.023、0.027和0.012,均<0.05,说明积水肾脏中AQP1-4蛋白相对表达量与患侧肾脏GFR之间呈正相关。积水侧肾脏肾实质厚度与积水侧肾脏GFR之间的相关性分析结果显示积水侧肾脏肾实质厚度与积水侧肾脏GFR之间的相关性系数r=0.728,P值为0.017,P<0.05,说明积水侧肾脏肾实质厚度与GFR之间呈正相关。结论通过上述三部分的研究得出以下结论。1.AQP1-4 mRNA和蛋白的表达在先天性积水肾脏中呈低表达,并且随着积水程度的加重,AQP1-4 mRNA和蛋白的表达越来越低。这提示在人类先天性积水肾脏中AQP1-4 mRNA和蛋白的表达量的降低与超声分级的肾积水程度的加重成一定的比例,AQP1-4的表达降低可能是引起积水肾脏形态功能改变的早期因素之一。2AQP1-4 mRNA和蛋白在IVP不显影积水肾脏中的表达明显下降。这提示AQP1-4在先天性积水肾脏中的表达降低,且随着IVP显影情况的不同而出现明显变化,表明AQP1-4在肾积水发展进程中可能与肾脏分泌功能的下降有一定的关系。3.小儿先天性积水肾脏中AQP1-4 mRNA和蛋白表达均下调,且随着积水肾脏病理改变的严重程度而变化。提示AQP1-4表达水平的变化可能在先天性肾积水的病理发展过程中发挥着一定的作用。4.积水肾脏中AQP1-4蛋白相对表达量与肾实质厚度、肾脏GFR之间呈正相关。这提示AQP1-4蛋白表达量下降与积水肾实质厚度和积水肾脏GFR的变化有一定的相关性,为进一步了解肾实质厚度越薄肾脏尿液浓缩稀释功能越差现象的机理研究提供了客观依据。