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支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，有众多的细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)、细胞因子、炎症介质等参与了其发病过程。目前有关抗原激发的急性气道炎症过程的研究已比较明确，然而造成哮喘长期反复发作的原因和发病机理仍不清楚。近几年来，有关气道重建的研究在国外成为一个热点课题，而国内的相关研究却鲜见报道。到目前为止，有关气道重建的定义及发生机制仍是有待解决的问题，但其基本的形态学表现为气道壁的增厚和气管腔的狭窄，气道上皮破坏，杯状细胞增生，粘膜下成纤维细胞增殖并过度合成和分泌胶原蛋白等而导致基底膜增厚，气道平滑肌细胞增生、肥厚，粘膜内微血管形成，以及血管壁通透性改变造成的粘膜水肿和炎症细胞浸润。其中细胞外基质(ECM)增多导致的基底膜增厚和气道平滑肌细胞增生、肥大是其最重要的改变。 TGF-β是一种具有免疫体调节功能的细胞因子。与正常对照组相比哮喘患者气道内的TGF-β水平明显增高。产生TGF-β1的细胞有淋巴细胞、巨噬细胞、上皮细胞。支气管哮喘患者的支气管粘膜上皮细胞、浸润的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞是TGF-β最重要的来源。这种细胞因子在驱动和增强气道炎症反应和气道重第四军医大学博士学位论文建中具有重要作用。TGF一p在哮喘气道重建中具有促胶原产生、增加细胞外基质沉积和诱导起到上皮细胞凋亡等重要作用，但TGF一pl对气道平滑肌的直接作用的研究尚未见报道。因此我们以MTT法和流式细胞仪检测体TGF一p对体外培养的气道平滑肌的增殖的作用，了解TGF一p在哮喘气道重建的一个重要方面，气道平滑肌增生的直接作用。 MAPK途径和PI一3K信号传递系统对气道平滑肌细胞进入S期有重要作用，是ASM细胞增殖的重要的信号转导途径。因此本试验通过MTT和流式细胞仪的方法观察TGF一pl对体外培养的大鼠ASM细胞增殖作用。应用特异性细胞外信号调节激酶1/2 (ERKI/2)抑制剂U一0126或Pl一3K抑制剂LY294002阻断细胞增殖的信号转导途径，观察TGF一日1诱导的大鼠ASM细胞增殖中可能的信号转导途径，从而更深一步了解TGF一pl诱导的哮喘气道重建的机制。 一、转化生长因子pl对大鼠支气管平滑肌增殖的作用 应用体外培养的方法，加入不同浓度的TGF一pl，通过MTT法和流式细胞仪观察其对ASMC增殖的影响。结果发现于细胞培养第2天，MTT法检测TGF一日1明显引起ASMC增殖，高于对照组和10%FCS引起ASMC增殖。镜下观察发现，1 0 pg·L一，TGF一pl组和100 pg·L一‘TGF~p组ASMC于培养第3天铺满96孔培养板，lpg·L一‘TGF一旦1和10%FCS组细胞于第5天铺满培养板。流式细胞仪检测细胞生长周期发现TGF一el促进S期细胞和GZ期细胞百分比明显增加，引起ASMC增殖变快。TGF一pl对气道平滑肌细胞的增殖具有明显的促进作用。 二、TGF一pl诱导的大鼠ASM细胞增殖的信号转导途径 在本研究中，MTT法和免疫组化图像分析结果显示:预先30min加入U一0126明显抑制了10pg.L一1 TGF一pl诱导的ASMC增殖。预先30min加入LY294002对ASMC增殖有抑制作用，但统计学上无差别。说明TGF一日1可能主要用过MAPK途径诱导ASMC增殖，ERKI/2是关键的信号分子。MTT法及免疫组化和图像分析第四军医大学博士学位论文结果表明，不同浓度TGF一pl诱导的ASMC磷酸化ERKI/2的表达不同，随着TGF一旦1浓度增加，ASMC磷酸化ERKI/2的染色越深。IOpg·L一‘TGF一p It匕zpg·L一‘TGF一pz诱导的磷酸化ERKI/2明显增高，100 p 9 .L一‘TGF一pl比10 pg·L一‘TGF一pl诱导的磷酸化ERKI/2增高，但不显著。说明在一定浓度范围内，TGF一pl诱导的磷酸化ERKI/2表达有剂量一效应关系，浓度越高磷酸化ERKI/2表达越多，ASMC增殖就越明显。我们分别在30min、60min、24h和48h检测TGF一pl诱导的ASMC phospho一ERKI/2的表达，均明显高于对照组。图像分析灰度值在不同时间点上无明显差异，说明TGF一pl能持续诱导ASMC表达phospho一ERKI/2，这对于TGF-已1诱导的ASMC增殖是至关重要的 结论: 1.TGF一pl增加了体外培养的ASMC中S期和GZ期细胞占总细胞数的百分比。 2.TGF一pl对气道平滑肌的增殖有明显的促进作用。 3.TGF一pl主要通过MAPK途径诱导ASMC增殖，ERK 1/2是关键的信号转导分子。 4.在一定浓度范围内，TGF一pl诱导的phospho一ERK一/2表达有剂量一效应关系，TGF一pl浓度越高phospho一ERKI/2表达越多，ASMC增殖越明显。 5.TGF一pl能诱导ASMC的phospho一ERKI/2持续表达，这对于ASMC增殖是至关重要的。