目的:成体造血干细胞存在于骨髓中,伴随机体终身,负责分化形成免疫系统的所有细胞。在肿瘤等疾病状态下,造血干细胞发生一系列特征性的发育变化,导致免疫力下降或肿瘤免疫逃逸。目前,对其中的细胞与分子基础仍不甚清楚。本研究着重比较分析荷瘤小鼠和正常小鼠骨髓造血干/祖细胞数量、细胞周期、增殖及潜在相关调节基因的表达,旨在探明造血干/祖细胞在荷瘤发生中发育变化的特点与规律及其调节机制。本研究结果还将增进对肿瘤细胞通过干扰造血干/祖细胞的免疫细胞发生从而逃避免疫监测的机理的了解,并为发展肿瘤疾病的免疫疗法奠定基础。方法:(1)肿瘤模型构建.:使用已被大量文献证明过的小鼠Lewis肺癌细胞(Lewis lung carcinoma line,LLC)模型。取处于对数生长期的LLC细胞于左腋皮下接种8-10周龄近交系C57BL/6J小鼠;四周后选择所长肿瘤大小适宜(直径约1.5cm)的动物用于实验。(2)骨髓细胞分离与制备:断颈处死小鼠,取胫骨与股骨,冲洗出骨髓。在裂解掉红细胞后,将骨髓制备成单细胞悬液。(3)细胞表型分析与分选:细胞用偶联荧光素的表面标志蛋白抗体进行标记,流式细胞分析仪分析细胞参数,通过流式细胞分选仪分选纯化特定细胞群。(4)细胞增殖分析:EdU用PBS制备成2.5mg/ml的溶液,按20mg/Kg体重的剂量腹腔注射小鼠,对照组小鼠注射PBS溶液。10h后,处死小鼠并分离骨髓细胞。细胞用偶联荧光的表面抗体进行标记,经固定渗透后用Click-iT试剂盒依照说明书对EdU进行染色。EdU阳性率由流式细胞分析仪检测,数据用Flowjo7.6.1进行分析。(5)细胞周期分析:细胞通过表面偶联有荧光的抗体进标记,经固定渗透后用7-AAD染色DNA。流式细胞仪检测细胞周期时相分布。数据用Flowjo7.6.1进行分析。(6)造血干/祖细胞发育基因mRNA检测:提取细胞总mRNA,逆转录成cDNA,PCR产物通过琼脂糖电泳检测。针对荷瘤鼠与正常鼠之间表达差异较大的基因,进一步通过荧光定量PCR法进行精确定量。(7)GMP细胞中irf8基因的蛋白质水平分析:从荷瘤鼠及正常鼠分离骨髓细胞并通过流式分选仪纯化GMP细胞,提取蛋白质,以β-actin为内参,Westernblot法定量IRF8蛋白质水平。(8)统计方法:采用SPSS统计软件对实验所得数据进行“独立样品T检验”分析,统计结果以平均值±标准差表示。结果:(1)骨髓造血干/祖细胞在肿瘤进程中呈现特征性的发育变化。为了解造血干/祖细胞在肿瘤进程中的变化,我们利用流式分析法同时测定了荷瘤小鼠和正常小鼠相应细胞群的含量。在荷瘤小鼠中,GMPs占骨髓细胞的比例为1.307±0.136%,显著高于生理状态下的GMPs含量(0.505±0.174%,P<0.01),二者的细胞绝对数分别为4.088±0.425×105和1.320±0.456×105(P<0.01)。肿瘤CMPs含量则低于生理状态下的含量(0.154±0.032%VS0.237±0.029%,P<0.05),CMP细胞绝对数在肿瘤条件无显著差异(肿瘤 CMPs:0.482±0.101 ×105 VS 正常 CMPs:为 0.621±0.076 ×105)。在生理和肿瘤状态下,MPPs 含量分别为 0.033±0.003%和 0.199±±0.040%(P<0.01),细胞绝对数分别为 0.087±0.008×105和0.622±0.124 ×105(P<0.01)。HSCs的肿瘤状态下含量为0.176±0.014%,正常条件下含量为0.033±0.007%(P<0.001),二者的细胞绝对数分别为0.550±0.042 ×105和0.087±0.018×105(P<0.001)。这些结果表明,在肿瘤状态下,除CMPs外,造血干/祖细胞包括HSCs、MPPs和GMPs均发生显著扩增。(2)骨髓造血干/祖细胞肿瘤进程中细胞增殖的变化细胞丰度的改变可能是因为细胞增殖变化造成的。接下来我们进一步检查了造血干/祖细胞在荷瘤和生理状态下的体内增殖情况。为此,通过腹腔注射EdU直接标记体内细胞DNA。结果显示,HSCs、MPPs和GMPs在肿瘤进程中的增殖能力显著上升。在肿瘤和正常小鼠状态下,EdU阳性细胞在HSCs中的比例分别为31.806±3.031%和13.530±2.413%(P<0.01),在 MPPs 中的比例分别为 50.375±1.289%和 46.009±±0.671%(P<0.05),在 GMPs中的比例分别为65.301±0.124%和52.435±0.967%(P<0.01)。与该细胞的细胞丰度和绝对数改变趋势相反,CMPs在生理和肿瘤状态下的增殖率分别为50.272±1.217%和62.308±8.011%(P<0.05)。这些结果表明,造血干/祖细胞在荷瘤状态下其细胞含量的变化是由于其增殖能力改变的结果。(3)骨髓造血干/祖细胞在肿瘤进程中细胞周期的变化。鉴于造血干/祖细胞在荷瘤状态下增殖能力改变,我们进而分析了造血干/祖细胞的细胞周期分布。细胞周期分析通过结合使用细胞表面抗原和7-AAD核内染色进行。HSCs在荷瘤状态下处于Go/Gi期、S期和G2/M期的细胞占比分别为81.795±1.378%、11.308±2.603%和7.208±1.831%,生理状态下HSCs处于相应时期细胞的百分比分别为87.250±0.779%、6.442±0.398%、6.624±0.709%。MPPs和GMPs也表现类似的变化。肿瘤状态下,Go/G]期、S期和G2/M期细胞在MPPs中的百分比例分别为63.849±5.062%、20.095±3.967%、14.299±3.055%,在 GMPs 中分别为 54.474±0.983%、32.678±2.044%、15.112±1.004%;生理状态下,G0/G1期、S期和G2/M期细胞在MMPs中的百分比例分别为70.203±1.691%、17.141±3.438%、12.632±1.526%,在 GMP 细胞中分别为 56.655±2.491%、31.617±2.331%、12.081±0.477%。与其细胞含量变化一致,CMPs在正常小鼠中的G0/G1期、S期和G2/M期所占比例分别为56.497±6.581%、27.787±3.944%、14.730±9.071%,在荷瘤小鼠中的相应比例分别为63.995±2.703%、26.195±3.959%、9.971±2.082%。这些数据不仅印证了造血干/祖细胞含量和增殖能力在肿瘤状态下变化的分析结果,而且还表明,肿瘤细胞可能通过刺激HSCs、MPPs和GMPs进入细胞周期而促进它们的分裂;另一方面,肿瘤细胞则通过促使CMPs停留或脱离细胞周期而降低其增殖。(4)肿瘤下造血干/祖细胞表达相关调节基因的变化为探明造血干/祖细胞在肿瘤进程中发育变化的分子基础,我们检测了系列相关基因在HSCs,MPPs,CMPs,GMPs四个细胞群中的表达。半定量PCR分析和荧光定量PCR分析显示,在肿瘤条件下,RUNX1在HSCs和MPPs中表达显著下调,分别为生理状态下的0.194±0.065 倍(P<0.01)和 0.253±0.066 倍(P<0.01)。PU.1 在荷瘤小鼠 MPPs 和 CMPs 中的表达也下降,分别为正常小鼠细胞的0.448±0.191倍(P<0.01)和0.272±0.106倍(P<0.05)。IRF8在肿瘤状态下在HSCs、MPPs、CMPs、GMPs四个群中表达均显著降低,分别为生理状态下的 0.283±0.048 倍(P<0.01)、0.403±0.094 倍(P<0.01)、0.081±0.070 倍(P<0.01)、0.205±0.092倍(P<0.01)。这些结果提示,不同转录因子参与特定阶段造血干/祖细胞发育的调节。结论:(1)肿瘤发生中小鼠骨髓造血干细胞生成免疫细胞的能力增加,但这种增加并非系统性而是主要向髓系细胞分化。分析不同发育阶段造血干/祖细胞的结果显示,肿瘤状态下,除CMPs外,HSCs,MPPs,GMPs三个细胞群的增殖速率显著加快,表明HSCs功能活性增强并快速通过CMPs进而分化形成GMP细胞。由于髓系发生通路中不仅下游细胞如单核细胞和粒细胞、而且早期髓系祖细胞均具有极强的免疫抑制活性,这项发现较好地解释了伴随肿瘤进程髓源性抑制细胞发生显著扩增的现象。(2)肿瘤发生中小鼠骨髓造血干/祖细胞的发育受特异转录因子调节。分析一系列免疫细胞发生相关转录因子的结果表明,RUNX1、PU.1和IRF8的表达在肿瘤进程中均呈现下降,其中RUNX1可能主要作用于HSCs、PU.1是调控CMPs从其前体的发育、IRF8则参与从HSCs至GMPs不同发育阶段细胞的调节。这些发现不仅提升了肿瘤发生中骨髓造血干/祖细胞发育的分子机制的认识,而且为肿瘤临床的免疫特定干预或基因疗法提供了理论基础。