N末端前钠尿肽(NT-proBNP),是从其氨基酸前体蛋白(pro-BNP)中的羧基端裂解而来含76个氨基酸的非活性多肽,是心衰时较好的心脏标志物[1],能反映心室容积扩大、心室超负荷和心脏功能有无损伤及损伤程度[2-5]。早在2000年“Heart”杂志在一篇名为“BNP:很快成为治疗心衰患者的常规措施”的编者社论中就明确认为脑钠肽或B型钠尿肽(brain natriuretic peptide, B-type natriuretic peptide; BNP)有助于诊断心衰,可作为心衰患者预后标志物,是一种新的监控心衰的方法。2002年,国际上已经公认脑钠肽前体,NT-proBNP,是测定心衰的一个划时代的具有特异性的标志物。目前,NT-proBNP的诊断试剂仅有国外几家大型医疗企业生产,价格昂贵,普及推广较难。同时,市场上也无出售能直接用于NT-proBNP检测的抗体及标准品,因此制备研制NT-proBNP检测用抗体及校准品,对弥补国内NT-proBNP检测试剂空白及改善进口试剂价格高昂的状况,本身就是一项巨大社会价值和经济价值的工作,同时也为建立具有完全自主知识产权的NT-proBNP电化学免疫传感器技术奠定基础。近年来基于免疫技术与电化学检测相结合的免疫传感器技术已有很大的发展,该方法不但能定量分析、且有可能开发出适合社区医院和床旁应用的快速检测产品,而倍受关注[6] ,由于NT-proBNP的正常人血清含量约0.1ng/ml,心衰时可达2-3ng/ml,现有的免疫传感器技术通常能检测到0.5ng/ml,建立NT-proBNP可靠的测定方法应该增敏至正常人血清NT-proBNP含量的下线左右,以及延长传感器的使用寿命、解决再生问题和检测电极的抗干扰能力提高检测特异性,以达到临床检测的要求。为了提高的生物传感器灵敏度,近年来,国内外一些学者采用不同的标记物来标记抗原或者抗体分子,以提高免疫传感器的灵敏度,并已取得了较好的进展[7]。在标记物中除了最常用的酶以外,还有金属或半导体的纳米颗粒及其它具有电活性的新型生物材料。我们在研究工作中,我们成功制备了NT-proBNP免疫检测的抗体及可以应用于临床的检测校准品,通过与Roche试剂临床检测对比,符合率达95%以上。在此基础上,以磁性微粒子偶联抗体结合本研究制备的可控磁场电极实现免疫传感器再生及快速检验;通过对抗体的片段化制备高活性的NT-proBNP Fab抗体应用于免疫传感器检测消除非标记检测中的非特异性物质的结合带来的假阳性;采用多层碳纳米管(CNTs)为NT-proBNP抗体的固相载体提高抗体吸附的表面积,以及金纳米链与辣根过氧化物酶复合物与配对NT-proBNP抗体结合的形式信号放大提高了检测灵敏度。通过以上研究,我们解决了NT-proBNP免疫传感器检测中的一些关键问题,为建立NT-proBNP免疫传感器检测技术,进一步实现NT-proBNP的临床免疫传感器检测产品研究奠定了基础。主要的研究内容和结果:1.心衰标志物NT-proBNP免疫检测用抗体及校准品研究1.1检测校准品制备及稳定性研究基因重组大肠杆菌(E.coli BL21 DE3)中表达的纯化的人NT-proBNP蛋白,确定最佳的稳定保存形式,结果表明:在含有0.3% Proclin300的PBS冻干保存NT-proBNP 6个月后其检测值仅降低<5%,用小牛血清溶解稀释后一个月其测定值仅降低<10%,具有良好的保存及检测结果。1.2 NT-proBNP多克隆抗体纯化及鉴定采用多肽偶联NHS活化偶联填料建立的亲和层析纯化及Protein A普通亲和层析结合的方式建立了的NT-proBNP多抗纯化技术,将多抗中含量仅1%的特异性IgG多抗纯化出来,每100毫升免疫血清获得抗体20毫克左右,纯化抗体具有高亲和力,同时具有类似单抗的表位特异性。1.3 NT-proBNP单克隆抗体的纯化及鉴定预纯化的单抗腹水经SiO2的吸附处理,经改良的Protein A填料Mabselect纯化,纯化抗体SDS-PAGE电泳纯度>95%,能有效去除抗体中的脂蛋白提高NT-proBNP单抗的纯度及特异性,更适宜抗体标记及片段化改造。1.4 NT-proBNP抗体的HRP标记通过改良优化的HRP标记方法,制备HRP标记的NT-proBNP单克隆抗体,标记的单抗稀释度达1:1000000,最终确定1:6000的稀释度应用于双抗夹心检测人NT-proBNP,达到临床检测效果,标记效果良好。1.5双抗夹心检测人NT-proBNP方法学建立及评价以制备的NT-proBNP单抗、多抗及检测校准品建立的NT-proBNP双抗体夹心化学发光检测试剂盒,其试剂盒检上限达到30000pg/ml,下限到100pg/ml,通过收集的234份临床标本与Roche的电化学发光试剂盒检测对照,符合率达到99% (P<0.001),验证抗体检测血清中天然NT-proBNP的能力。2.心衰标志物NT-proBNP免疫传感器特异性与免再生研究2.1 NT-proBNP单克隆抗体Fab抗体的制备及应用使用木瓜蛋白酶酶切单克隆抗体制备Fab抗体,酶切后采用抗原偶联NHS活化偶联填料及Protein A纯化获得的Fab抗体具有高活性及彻底的除掉Fc段,采用该方法制备的NT-proBNP Fab抗体纯度95%以上,Fc段切除率接近100%。2.2 Fab抗体应用于提高NT-proBNP免疫传感器特异性通过双单克隆抗体建立的双抗夹心检测人NT-proBNP方法从收集的40例风湿病人血清及216份阴性体检血清中分别筛选出6份和2份经Roche检测为阴性的假阳性标本,通过将单克隆抗体Fab化应用于免疫传感器检测,8份血清均检测正常,消除了非标记系统免疫传感器检测中因风湿因子、补体系统、抗鼠抗体等带来的假阳性。2.3 NT-proBNP抗体的生物素化采用Pierce生物素化试剂盒对抗体进行生物素化,选择EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin标记试剂盒,是一种长臂生物素,分子量为669.75,臂长30.5 (?),提高检测灵敏度。标记的抗体采用间接ELISA检测稀释度达1:1000000。2.4免再生NT-proBNP免疫传感器的构建以亲和素包被磁性微粒子为固相载体,捕获反应体系中形成的生物素化抗体-抗原-二抗形成的免疫复合物,达到检测目的。并通过自行设计的可控磁场电极进行检测、洗脱、再检测的连续检测形式,实现免再生。2.5基于Fab抗体构建的免再生NT-proBNP免疫传感器检测效果评价在电化学免疫传感技术研究的基础上,设计、构建了新型的磁场可控电极,并结合生物素化NT-proBNP Fab抗体、亲和素包被磁性微粒子,实现了NT-proBNP标准品及临床样本中NT-proBNP的快速、便捷、免再生检测。结果显示,使用该方法构建的免疫传感器检测技术灵敏度达到0.03 ng/mL,线性范围0.04～2.5 ng/mL,相关系数R=0.9827,具有良好的检测效果;Fab抗体较全抗体消除了收集的8份假阳性血清;同时,该检测方法实现了电化学免疫传感技术由器材向试剂化发展的转折,便捷化、实用化,为电化学免疫传感技术向临床应用过渡研究奠定了工作基础。3.心衰标志物NT-proBNP免疫传感器超敏检测研究3.1多层碳纳米管(CNTs)固相载体的制备及应用为了将多层碳纳米管能有效的固定与检测电极表面,我们采用非共价结合的方式先酸处理CNTs,然后结合BSA。结合BSA蛋白的CNTs能被吸附在金电极表面,同时避免用共价方式结合后CNTs电子传递受影响的后果,并且结合BSA后的金电极可进一步与胶体金结合,偶联目的抗体分子。通过循环伏安法(CV)考察,所制备的电极具有良好的电流响应性。3.2金纳米链、辣根过氧化物酶与二抗复合物的制备及应用以抗坏血酸为反应媒介,促进HAuCl4溶液与NT-proBNP二抗及辣根过氧化物酶(HRP)形成链状复合物。通过透射电镜(TEM)考察其制备效果,结果达到预计效果。对比普通胶体金结合二抗,极大的提高了检测灵敏度。3.3基于多层碳纳米管及金纳米链与辣根过氧化物酶复合物构建的NT-proBNP免疫传感器检测效果评价采用多层碳纳米管(CNTs)为固相载体提高吸附表面积,增加电极表面一抗固定量,同时以及金纳米链与辣根过氧化物酶复合物与二抗结合的形式信号放大,达到双重放大效应,极大的提高了检测灵敏度。通过循环伏安法(CV)考察了电极表面的电化学特性,并对该免疫传感器的性能进行了详细的研究。研究结果显示,该传感器检测灵敏度达到6pg/mL,线性范围为0.02 -100ng/mL( R = 0.997),明显高于NT-proBNP临床检测的灵敏度要求(0.1 ng/mL)。同时对该免疫传感器也被研究证实具有良好的选择性和再生性能等,为进一步研究适合临床应用的NT-proBNP电化学免疫传感器产品奠定工作基础。