[研究背景]随着人们物质生活水平的不断提高,糖尿病尤其是2型糖尿病的患病率在全球范围内急剧上升。有数据显示,目前全球糖尿病患病人数已达2.4亿,专家预测到2025年,该数字将突破3亿。糖尿病的广泛流行,不仅严重威胁到人类的健康,同时也给整个社会带来了沉重的经济负担,糖尿病的预防和治疗已成为一个重大的全球性公共卫生问题。探讨和研究2型糖尿病的病因及发病机制,是预防和治疗2型糖尿病的基础。近年来,研究发现2型糖尿病患病率的增高,不能仅仅归因于人类基因、饮食结构、营养状况的改变,平均寿命的延长,或是平日运动的减少,肠道菌群是控制体重和能量代谢的一个重要环境因素,并且与肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病密切相关。肠道菌群是个复杂的细胞群体,它包含有数量巨大、种类繁多、约1014细菌细胞,其数量是人类基因数量的100倍还多。有学者认为,肠道菌群可被看作是人体内的一个“微生物器官”,这个“微生物器官”在体内发挥着许多重要的功能。目前已有研究表明,肠道菌群是参与脂代谢、促进肥胖和2型糖尿病等代谢性疾病发生的一个重要因素。2型糖尿病患者存在肠道菌群的失调,表现为肠杆菌科细菌含量增加,类杆菌含量减少等。肠道菌群可以显著增加宿主能量的摄取、增加脂肪的储存,可以通过增加肠道中单糖的吸收和肝脏甘油三酯的合成等途径来促进胰岛素抵抗的发生发展,从而引起2型糖尿病的发生。还有学者认为,饮食因素诱导的肠道菌群失调,可产生对机体不利的代谢产物并引起代谢性内毒素血症,进而引发机体的炎症反应并出现胰岛素抵抗,最终导致2型糖尿病的发生双歧杆菌是人体肠道菌群中的优势菌属,也是常见的的益生菌之一,在维持肠道菌群与宿主之间相互作用的稳定、保证宿主正常的新陈代谢等方面发挥着重要的作用。双歧杆菌数量的减少可导致整个肠道菌群失调和肠道微生态失衡,从而导致许多代谢性疾病的发生。有研究表明,双歧杆菌可以有效改善糖耐量和葡萄糖诱发的胰岛素分泌功能,降低高脂饮食诱导的糖尿病小鼠内毒素血症和血浆脂肪组织的促炎症因子水平,使小鼠的低浓度炎症好转,从而改善糖尿病代谢紊乱的状态。还有研究发现,青春双歧杆菌可以有效改善2型糖尿病大鼠肠道菌群的失调和脂质代谢紊乱等症状。同时,双歧杆菌已被广泛用于肠道相关疾病的预防和治疗,并表现出很好的功效。许多双歧杆菌及含双歧杆菌的制剂可以通过口服途径来促进肠道有益菌的生长,在肠道菌群相关疾病的治疗方面具有广阔的应用前景。因此,研究2型糖尿病患者肠道双歧杆菌的变化规律有着十分重要的意义。肠道菌群的定量是了解2型糖尿病患者肠道菌群变化规律的有效技术手段,目前国内学者多采用传统的细菌定量方法来研究,即培养计数法。但该方法操作过程中容易受到外界环境、培养基、操作方法等因素的影响,不仅费时费力效率低,而且计数不准确,其结果缺乏稳定性。因此,建立一种能够快速、准确定量肠道菌群的稳定方法是十分必要的。实时荧光定量PCR技术,是一种敏感性高、特异性强的定量方法,可以快速、准确、简便地对肠道菌群进行定量,并且具有高通量、污染小、稳定性好等优点。目前关于2型糖尿病患者与健康个体之间肠道双歧杆菌差异的研究仍较少,并且国内外对于双歧杆菌的不同菌种在2型糖尿病患者肠道中如何变化的研究尚属空白。本课题根据不同细菌的16SrRNA序列设计属种特异性引物,应用实时荧光定量PCR技术对2型糖尿病患者和健康个体的肠道双歧杆菌(包括双歧杆菌总菌及其常见的4个菌种：长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌)进行定量分析,并分析这些肠道细菌与2型糖尿病患者临床特征的相关性,从而为进一步研究肠道双歧杆菌与2型糖尿病的关系提供依据。[目的]1.定量分析2型糖尿病患者和健康个体之间肠道双歧杆菌总菌、肠道长双歧杆菌、肠道短双歧杆菌、肠道青春双歧杆菌、肠道婴儿双歧杆菌的差异。2.分析2型糖尿病患者肠道双歧杆菌总菌、肠道长双歧杆菌、肠道短双歧杆菌、肠道青春双歧杆菌、肠道婴儿双歧杆菌与患者的一般临床及实验室指标的相关性。[方法]1.根据严格的纳入及排除标准,选取广东省佛山市顺德明景糖尿病医院的50例2型糖尿病患者及30例前来体检的健康志愿者。2型糖尿病患者根据WHO1999版糖尿病诊断标准。对所有入选者进行详细的病史及既往体检资料的询问,进行体表测量并填写相关的基线资料登记表,测量他们的身高、体重等,计算体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)。2.采集2型糖尿病组入选者的血标本,测定空腹血浆葡萄糖(FPG)、餐后2h血浆葡萄糖(2hPG)、空腹C肽(FCP)、餐后2hC肽(2hPCP)、糖化血红蛋白(HbAlc)、C反应蛋白(CRP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)3.采集所有入选者的粪便标本,进行粪便标本的预处理：称取湿重粪便样品每份2g于无菌离心管中,加入20ml灭菌PBS充分振荡混匀,反复离心后收集沉淀(菌体)。4.粪便细菌总DNA的提取：按细菌DNA提取试剂盒说明书步骤进行,所提取出的DNA通过紫外分光光度计测定。5.标准曲线的制备：根据双歧杆菌总菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌的16SrRNA基因序列,设计属种特异性引物,进行常规PCR反应扩增目的基因并纯化回收PCR产物,构建标准品质粒后,作为阳性模板在7500Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems, USA)上进行实时荧光定量PCR反应,得到标准曲线。6.粪便标本的细菌定量：将80份粪便标本进行实时荧光定量PCR反应,可得到80份粪便标本中分别含双歧杆菌总菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌的数量。7.统计学处理：采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。计量资料结果经正态性检验,服从正态分布的资料以x±s表示,两组间差异的比较用两独立样本的t检验；若不服从正态分布,以中位数(四分位数间距P25-P75)表示,组间差异的比较用两独立样本非参数Mann-Whitney U检验。肠道细菌与各糖脂代谢等指标符合正态分布的采用Pearson(?)目关分析,若非正态分布的用Spearman相关分析。P<0.05作为差异有统计学意义。[结果]1.两组人群粪便标本的细菌定量：2型糖尿病组肠道双歧杆菌总菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌的定量结果分别为10.97(10.25～11.26)、3.49(3.26-3.81)、3.94(3.76-4.13)、3.44(3.34-3.57)、3.80(3.23-4.66),健康对照组分别为11.56(10.97-11.92)、3.68(3.30-4.48)、4.02(3.52-4.12)、4.01(3.72-4.28)、4.23(2.92-4.72)。与健康对照组相比,2型糖尿病组肠道双歧杆菌总菌和青春双歧杆菌的数量均显著减少,差异均具有统计学意义(两者均P=0.000),而长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌的数量两组间无显著性差异(P=0.101,0.676,0.964)。2.相关分析发现2型糖尿病患者肠道双歧杆菌总菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌拷贝数与FPG、2hPG、HbAlc、CRPFCP、2hPCP、TC、TG、HDL-C、LDL-C无相关性(均P>0.05)。[结论]1.2型糖尿病患者出现了肠道双歧杆菌的失调,表现为双歧杆菌总菌、青春双歧杆菌的数量减少,肠道双歧杆菌属、青春双歧杆菌种可能在2型糖尿病的发病中起着一定的作用。2.肠道双歧杆菌的数量可能与2型糖尿病患者的糖、脂代谢紊乱,胰岛功能和患者体内炎症水平现状态无直接关联。