中药陈皮来源于芸香科Rutaceae柑橘属Citrus L.植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。橘的栽培品种较多,地域分布广泛,我国长江以南各省均有栽培,作为陈皮来源品种的橘类植物主要为宽皮柑橘类,栽培品种有茶枝柑C.reticulata’Chachi’、红橘C. tangerina Hort. et Tanaka、樟头红C. reticulata Blanco cv. zhangshuensi、南丰蜜橘C. reticulata Blanco cv. Kinokuni、福橘C.reticulata’Tangerina’等,主产于广东、四川、重庆、江西、福建等地。陈皮是中药多栽培品种入药的代表药物,近年来由于柑橘品种不断更新交替以及栽培更重视其食用价值,加之2010年版《中国药典》对陈皮来源橘的栽培变种未作进一步规定,药典收载的质量标准也无法客观评价各栽培变种的品质差异,造成陈皮传统来源品种大红袍等面临淘汰,而一些药用质量未经评价的柑橘品种以“杂陈皮”流通于市场,导致陈皮药材质量问题突出,临床疗效难以保证。因此,亟需对市场上流通的陈皮入药品种的遗传差异、化学成分、药理作用等进行系统评价研究,为进一步规范陈皮入药品种,确保陈皮药材质量稳定可控和临床用药安全有效提供科学依据。本文首次对川陈皮传统来源品种大红袍C.reticulata ’Dahongpao’(红橘品系)、赣陈皮来源品种南丰蜜橘和樟头红中主要药效成分一黄酮、总酚酸、生物碱、多糖含量在不同采收期内的动态变化进行研究,明确不同药效成分的动态变化规律,为选择陈皮入药品种的次生代谢产物的等同性研究奠定基础；并对大红袍果实发育期(7-12月份)内叶片和果皮中黄酮类成分的合成积累与3种次生代谢关键酶(PAL、C4H、4CL)活性的关系进行系统研究,首次初步阐释了大红袍果实发育过程中黄酮类成分生物合成代谢机制,揭示了陈皮成分积累与陈皮入药成熟度的科学内涵,为进一步规范陈皮传统入药品种的采收加工提供依据；对陈皮传统入药品种茶枝柑、大红袍、南丰蜜橘及其市场上混杂入药的柑橘品种天草C. reticulata hybrid等22个柑橘品种的遗传多样性及DNA条形码进行研究,以期为陈皮种质资源的开发和合理利用提供参考,也为陈皮入药品种的进一步筛选提供遗传学依据。具体研究内容及结果如下：1不同栽培品种陈皮药材主要药效成分动态变化研究本研究采用HPLC法测定不同采收期大红袍、樟头红、南丰蜜橘中4种主要黄酮类成分芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素和生物碱类成分辛弗林的含量,UV分光光度法测定总黄酮、总酚酸和多糖的含量。结果表明：3个栽培品种中黄酮类成分芸香柚皮苷、川陈皮素、橘皮素和辛弗林均随采收时间的推迟而逐渐降低至果实成熟时趋于稳定。橙皮苷、总黄酮和总酚酸、多糖在整个采收期内呈现起伏波动的变化趋势,橙皮苷、总黄酮和总酚酸在整个采收期内的总体变化呈下降趋势,橙皮苷和总黄酮在幼果期至果实成熟前含量均呈降低趋势,在果实成熟后含量有所回升；总酚酸在果实膨大期至着色期含量变化幅度较大,先迅速升高,后持续降至果实成熟时趋于稳定；多糖在果实着色期前均持续升高至着色期后急剧下降,于成熟期含量大幅上升至最高水平。从各药效成分在整个采收期内的积累量来看,3个品种中黄酮类成分芸香柚皮苷的含量存在明显差异,其积累量的相对高低为樟头红>南丰蜜橘>大红袍；橙皮苷、总黄酮及其生物碱类成分辛弗林的含量也存在明显差异,其含量高低为南丰蜜橘>大红袍>樟头红,而其它类成分的积累量差异不明显,原因可能与调控黄酮类成分合成积累的次生代谢关键酶的活性表达有关,具体的调控机制还有待继续深入研究。该研究初步明确了3个栽培品种陈皮中主要药效成分的动态变化规律，为进一步选择陈皮入药品种的次生代谢产物的等同性研究奠定基础。2大红袍叶片、果皮中黄酮类成分积累的初步研究对大红袍、南丰蜜橘、樟头红中主要药效成分的动态变化研究表明,3个栽培品种中黄酮类成分橙皮苷和总黄酮的含量随果实发育期的推迟存在明显差异。本研究首次以川陈皮来源品种大红袍叶片和果皮为对象,对其果实发育的幼果期至成熟期内(7-12月份)叶片中黄酮类成分积累与其次生合成代谢关键酶PAL、C4H、4CL活性的相关性及其同期果皮中黄酮类成分积累的内在关联性进行系统研究,共比较了40批大红袍叶片和果皮样品。2.1大红袍叶片中黄酮类成分积累与其次生代谢3种关键酶的相关性研究本研究在前期课题组研究基础上建立了UPLC测定大红袍叶片中橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量方法,对不同采收期内大红袍叶片中3种主要黄酮类成分的含量进行测定,并运用UV分光光度法追踪测定了叶片中黄酮类成分合成代谢的3种关键酶PAL、C4H、4CL活性和总黄酮的含量,分析黄酮类成分积累与3种关键酶活性的关系。结果表明：大红袍叶片中橙皮苷和总黄酮的积累与PAL、 C4H活性从果实发育的幼果期到膨大期内呈现相似的变化趋势,橙皮苷和总黄酮的含量逐渐增加,PAL、C4H酶的活性也逐渐升高,从果实着色期至成熟期出现了分化,橙皮苷和总黄酮含量持续升高,而PAL、C4H活性持续降低,而在整个采收期内二者含量与4CL酶活性之间没有明显的关系；4CL酶活性的变化与川陈皮素和橘皮素含量之间也呈现相似的变化,从果实膨大期至着色前期呈现先降低后升高的同步变化趋势,之后从果实着色期至成熟期出现分化,川陈皮素和橘皮素含量升高,4CL酶活性降低,而在整个采收期内二者含量与PAL、C4H酶活性的关系不明显。大红袍叶片中黄酮类成分积累与3种次生代谢合成关键酶出现分化的具体原因可能与其栽培环境的变化及调控黄酮类成分合成的其他关键酶活性的调控有关,其中复杂的合成代谢调控机制还有待进一步深入研究。该研究初步揭示了大红袍叶片中黄酮类成分生物合成积累与PAL、C4H、4CL关键酶活性的关系,为研究大红袍叶片中黄酮类成分的合成代谢机制奠定基础。2.2大红袍叶片与果皮中黄酮类成分积累的内在关联性研究为进一步深入研究大红袍果皮中黄酮类成分合成积累的代谢机制,本研究在对大红袍叶片中黄酮类成分合成积累研究的基础上,对同期采集的大红袍果皮中黄酮类成分的积累进行系统研究,利用HPLC法测定了与叶片同期采收的大红袍果皮中3种主要黄酮类成分橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量,并运用UV分光光度法测定其叶片中总黄酮的含量,分析大红袍果实发育期内大红袍果皮和叶片中黄酮类成分积累的内在关联性。结果表明：在大红袍果实发育的幼果期到成熟期内叶片和果皮中黄酮类成分的变化趋势不尽相同,在果实发育的膨大期到成熟期内二者黄酮类成分的积累变化较为明显,呈现出增减互补的变化趋势,叶片中橙皮苷和总黄酮的含量随成熟度的增加逐渐升高,而果皮中橙皮苷和总黄酮的含量逐渐降低,叶片中橘皮素和川陈皮素含量随成熟度的增加缓慢升高,而果皮中则逐渐降低。该研究初步表明了大红袍叶片和果皮中黄酮类成分积累的内在关联性,为阐释大红袍中黄酮类成分积累与陈皮入药成熟度的相关性研究奠定基础。3不同栽培品种柑橘的遗传多样性分析研究本研究对市场上流通的陈皮入药品种进行遗传多样性分析研究,为进一步筛选陈皮入药的柑橘品种提供遗传学依据。采用AFLP分子标记技术对茶枝柑、福橘、大红袍、南丰蜜橘、樟头红、天草等22个柑橘品种进行遗传多样性研究。结果表明：从12对EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ引物组合中筛选出6对引物,对样本进行PCR批量扩增,经高效毛细管电泳检测得到的样本DNA多态性条带总数为472条,多态性比例达到80%以上,平均每对引物扩增出78条DNA多态性条带,能够较好地反映柑橘样本间的遗传信息。且基于遗传相似性系数构建的UPGMA聚类图能够将不同栽培品种的茶枝柑、大红袍、福橘、椪柑、脐橙、不知火、天草等各聚为一类,其中同一品种不同产地的茶枝柑、大红袍、椪柑、脐橙、天草等各聚为一类,表明品种间的遗传差异受地域的影响较小；化学成分相似的南丰蜜橘和樟头红也单独聚为一类,与正品茶枝柑比较椪柑与其亲缘关系最近,而毛气柑与其亲缘关系最远。以上研究结果显示AFLP分子标记能够较好地界定划分不同栽培品种的柑橘,从DNA水平上表征了柑橘各栽培品种的遗传多样性,建议在进行陈皮入药品种筛选时可以从与陈皮道地品种亲缘关系较近的柑橘品种入手。4不同栽培品种柑橘的DNA条形码初步研究本研究以陈皮主要栽培品种茶枝柑、大红袍、南丰蜜橘等13个柑橘品种为研究对象,以ITS2序列为基础对其进行DNA条形码分子鉴定分析研究。结果表明：基于K2P距离构建的NJ发育树不能较好地区分鉴定各陈皮栽培品种,研究结果与文献报道一致。原因在于陈皮来源植物宽皮柑橘的栽培品种之间普遍存在自然杂交和芽变现象,特别是经杂交育种的杂柑(天草、不知火等),其DNA片段上仅存在少数位点的单核苷酸变异,其ITS2序列存在高度相似性。因此,仅从具有特征片段的DNA条形码序列难以进行区分,但ITS2序列在研究柑橘属植物亲缘关系方面仍然具有很大潜力。