疫霉菌属于茸鞭生物界卵菌门,是一种丝状真核生物,但在进化上与真菌相差很大。疫霉菌有上百种,大多为植物病原菌,生产上常年危害各种粮食作物、园艺作物和各类林木。其中具有代表性的病菌是致病疫霉,其侵染马铃薯引起的马铃薯晚疫病曾在1840年造成爱尔兰饥馑。马铃薯晚疫病在我国常年发病面积超过栽培面积的40%,是限制我国马铃薯产业发展的重要因素之一。目前生产上主要通过种植抗病品种和施用杀菌剂防治此类病害,但疫霉菌田间快速变异的特点为防治工作增加了难度。解析疫霉菌致病机制对理解病害发生过程及病害防控具有重要指导价值,而从表观遗传角度阐明疫霉菌致病调控机制可为疫病防控提供新思路和新方法。N6-甲基腺嘌呤（m6A）修饰是mRNA上的最普遍、含量最丰富的修饰,其相关研究目前属于表观遗传学的前沿方向。m6A修饰可以参与生物的多种生命进程,具有普遍而重要的生物学意义。m6A修饰组分包括甲基转移酶、去甲基酶及阅读蛋白。含YTH结构域的蛋白是发现的第一类m6A阅读蛋白,YTH家族蛋白通过影响mRNA代谢,如mRNA的降解、稳定及出核等,进而影响翻译效率,从而参与各种生命进程。近期疫霉菌DNA甲基化的类型、含量及分布等有了详细报道,然而RNA上的修饰尚不清楚,为进一步解析疫霉菌表观遗传修饰网络,便对疫霉mRNA上的m6A修饰进行研究。本课题以疫霉属中两个重要的植物病原菌大豆疫霉（Phytophthora sojae）和致病疫霉（Phytophthora infestans）为研究对象,从疫霉菌含YTH结构域的蛋白入手,对其是否参与调控疫霉菌的侵染过程及是否是疫霉菌mRNA的m6A阅读蛋白进行了研究,主要开展了如下工作:系统鉴定并分析了大豆疫霉和致病疫霉中含有YTH结构域的蛋白。通过同源序列比对,在包含疫霉属,水霉属和腐霉属的11种卵菌中,均发现含YTH结构域的蛋白。其中大豆疫霉及致病疫霉中分别存在两个含YTH结构域的蛋白,大豆疫霉中命名为PsYTH1和PsYTH2,致病疫霉中命名为PiYTH1和PiYTH2。进化树分析表明,PsYTH1与PiYTH1为同源蛋白,并且与人类胞内YTH蛋白遗传距离更近,而PsYTH2与PiYTH2为同源蛋白,与人类核内YTH蛋白遗传距离更近。结构域分析表明:PsYTH1和PiYTH1只含有一个保守的YTH结构域,而PsYTH2和PiYTH2除了含有一个YTH结构域外,还含有一个发育和细胞坏死相关结构域（DCD,Development and cell death）以及四个锌指结构域。关键酶活位点分析表明:大豆疫霉和致病疫霉中YTH结构域蛋白含有与m6A识别及结合有关的关键位点。对大豆疫霉里的PsYTH1和PsYTH2的表达谱分析及qPCR验证表明这两个基因在侵染前期上调表达,推测参与侵染过程。以上结果说明卵菌里含有保守的YTH结构域蛋白可能参与调控疫霉侵染过程。通过遗传学实验证明PsYTH1基因参与调控大豆疫霉营养生长及致病性。首先,利用CRISPR/Cas9技术制备大豆疫霉PsYTH1基因敲除突变体,通过PCR及测序验证得到了 3个敲除突变体:T2、T10和T16。其次,对这三个敲除突变体的表型进行鉴定:发现敲除突变体生长速率显著下降;游动孢子接种大豆黄化苗下胚轴侵染实验结果表明敲除突变体致病性显著下降;漆酶活性实验证明突变体漆酶活性下降;对侵染48小时后的大豆黄化苗下胚轴进行考马斯亮蓝染色后撕取上表皮进行显微镜观察:野生型侵染菌丝呈现出长、直的细胞间穿行状态,而敲除突变体侵染菌丝则更多地团聚缠绕在侵染点附近。最后,为进一步验证PsYTH1基因的功能,对敲除突变体T16进行了原位回补。PCR及测序验证得到了 3个回补突变体R1,R35,R42。对回补突变体的生长速率检测,发现可以部分回补敲除突变体的表型。致病性检测发现回补突变体与敲除突变体没有差异。以上结果说明大豆疫霉PsYTH1基因确实参与调控营养生长及侵染过程。psyth1敲除突变体组蛋白H3K27me3修饰水平没有变化。大豆疫霉ChIP-seq数据显示,PsYTH1基因位点附近有H3K27me3沉积。为明确疫霉菌的组蛋白修饰与RNA甲基化修饰间是否具有一定关系,故检测了psyth1敲除突变体蛋白的总体H3K27me3修饰水平。提取野生型（P6497）及psyth1敲除突变体的菌丝总蛋白,用特异性抗体H3K27me3进行Western blot检测,结果发现二者H3K27me3修饰水平没有显著差异。之前文章报道大豆疫霉敲除Pssu（z）12后,菌丝蛋白总体H3K27me3修饰水平下降,故本实验中检测了大豆疫霉野生型及pssu（z）12敲除突变体中PsYTH1基因的表达量,没有检测到差异,以上结果说明目前没有证据表明PsYTH1基因与组蛋白H3K27me3二者存在关系,对二者关系的研究还需要更多的实验支持。重组PsYTH1蛋白的体外表达及其核酸结合功能的检测。通过对PsYTH1基因的编辑,发现该基因确实参与大豆疫霉的侵染过程,为验证PsYTH1是否由于作为m6A阅读蛋白发挥功能参与致病过程,因此通过大肠杆菌原核表达系统表达PsYTH 1蛋白、其酶活突变体蛋白PsYTH1-m及空载体蛋白后进行核酸结合能力检测,其中酶活突变体突变位点为人类YTHDF家族蛋白报道过的m6A识别及结合位点。对诱导表达的蛋白分别进行AKTA纯化和富集后,通过核酸酶酶切琼脂糖凝胶迁移实验证明PsYTH1确实与RNA结合,为了进一步验证PsYTH1是否更倾向于结合有m6A修饰的单链RNA探针,又进行了 EMSA实验的探索。