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多糖是一类广泛存在的大分子化合物,植物多糖因具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖等多种生理活性而引起人们的关注。桑叶是一种传统的药食两用资源,在我国资源丰富。多糖是桑叶中的主要化学成分之一,因此,开发利用桑叶多糖具有重要的理论价值和研究意义。本研究以广东“大10”桑叶为试验材料,探讨了桑叶多糖的最佳提取工艺,并考察其对正常小鼠的免疫调节作用。对桑叶多糖进行分离纯化,并对所得各组分进行免疫活性评价,筛选出桑叶活性多糖。在此基础上,对桑叶活性多糖组分进行基本理化性质和结构初探。主要研究结果如下:
1.桑叶多糖提取工艺的优化:采用超声-微波协同萃取法提取桑叶多糖,通过Composite-Central原理设计和响应面分析,优化出提取桑叶多糖的最佳工艺条件为:以大10干桑叶粉为材料,提取温度76℃,提取时间807s,pH值6.16,水料比为40:1,该条件下的多糖提取率为10.05%。
2.桑叶多糖的免疫调节活性评价:通过正常小鼠体内试验评价桑叶多糖的免疫调节活性,结果表明,与正常对照组相比,125、250、500mg/(kg·bw)剂量组桑叶多糖均可显著提高小鼠校正碳廓清指数、血清溶血素水平、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力及NK细胞的活性;125mg/(kg·bw)剂量组桑叶多糖可显著提高小鼠胸腺指数;125、250mg/(kg·bw)剂量组桑叶多糖可显著刺激小鼠血清中细胞因子TNF-α的产生;125、250、500mg/(kg·bw)剂量组桑叶多糖可显著刺激小鼠血清中细胞因子IFN-γ的产生。提示125、250mg/(kg·bw)剂量组桑叶多糖对小鼠的免疫调节具有一定的增强作用。采用体外脾淋巴细胞增殖作用试验评价桑叶多糖的免疫调节活性,结果表明,200μg/mL剂量桑叶多糖能够明显刺激脾淋巴细胞增殖,400μg/mL剂量桑叶多糖能够明显刺激ConA诱导的脾淋巴细胞增殖,300μg/mL剂量桑叶多糖能够明显刺激LPS诱导的脾淋巴细胞增殖。提示桑叶多糖对体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖的调节作用呈现一定的剂量依赖关系。
3.桑叶多糖的分离纯化及各组分的体外免疫调节活性评价:采用Sevag法和D101大孔树脂法对桑叶多糖进行脱蛋白脱色处理,然后用DEAE-52纤维素柱层析对桑叶多糖进行分离纯化,并结合各分离组分在不同浓度条件下对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响比较,分离得到活性组分PML2,经纯度鉴定证明其为相对均一成分。
以PML、ConA+PML及LPS+PML组作为桑叶多糖免疫活性跟踪的指标,比较桑叶多糖协同不同丝裂原对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响,结果表明,PML2体外对小鼠脾淋巴细胞的刺激增殖作用显著高于PML3,ConA+PML2组的刺激增殖作用显著高于ConA+PML3组。
4.桑叶多糖的结构初探:分析PML2的理化性质,结果表明,PML2是一种不含单糖、多酚和蛋白质的非淀粉类多糖。HPGPC法测定PML2的相对分子量为2.54×104Dal。PML2主要是由半乳糖、葡糖糖、阿拉伯糖、甘露糖和核糖组成的杂多糖。红外光谱分析表明PML2含有β-糖苷键。