番木瓜SGT1和RAR1表达载体的构建及功能分析

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SGT1、RAR1在植物的抗病信号传导过程中起到非常重要的作用,SGT1一方面在细胞周期中是一个必不可少的调控子,参与到植物的早期生长发育过程,另一方面作用于多种植物抗病反应过程;RARl在R基因介导的信号转导途径中是一个早期的集合点;SGT1-RAR1复合体与COP9两个信号小体互作,互作体是抗病反应与泛素化的一个连接体。本实验采用RT-PCR方法克隆到番木瓜中的SGT1和RAR1基因,并且构建了pBI121-SGT1-RAR1表达载体,通过花滴法进行转化得到转基因拟南芥,与之前已得到的四种转基因拟南芥pBI121-SGT1-GUS、pBI121-SGT1、pBI121-RAR1-GUS、pBI121-RAR1进行鉴定SGT1和RAR1在拟南芥中的作用。主要研究结果如下:1.通过T2代转基因拟南芥与野生型Col-0拟南芥的形态学差异对比,在主根长度、侧根数目、抽花薹期以及花轴长度方面等均有差异。结果表明,SGT1在拟南芥早期的生长发育过程中起到一定的作用。2.在有渗透胁迫及盐胁迫存在的条件下,对转基因拟南芥与野生型Col-0拟南芥的发芽率以及根长的差异做了分析,在甘露醇存在时3种RAR1超表达的转基因拟南芥(pBI121-SGT1-RAR1、pBI121-RAR1-GUS、pBI121-RAR1)的发芽率分别为95%、76%、88%,相对于SGT1超表达的转基因拟南芥的发芽率高很多。表明在渗透胁迫条件下,RAR1有增强拟南芥发芽率的作用。检测渗透胁迫对根长的影响,结果显示pBI121-RAR1转基因拟南芥比其余4种转基因及野生型拟南芥对于胁迫条件的敏感程度更强,RAR1超表达的转基因植株相对于SGT1超表达的和野生型拟南芥对于盐胁迫的敏感程度也要高。SGT1参与到拟南芥发育过程的胁迫抗性反应中,增强了对胁迫条件的抗性。3.用pBI121-SGT1和pBl121-RAR1转基因拟南芥植株做氧化胁迫抗性分析实验,结果表明在处理48h.后,野生型拟南芥叶片有很严重的褐化干枯现象,然而在pBI121-SGT1和pBI121-RAR1转基因拟南芥植株上的褐化干枯现象延迟发生,这种现象表明pBI121-SGT1和pBI121-RAR1转基因拟南芥增强了对氧化胁迫的抗性。4.采用离体叶片接种法对拟南芥进行核盘菌(Ep-1PNA367)的接种,在侵染39h.后,病斑布满整个野生型拟南芥的叶片,但是在转基因拟南芥叶片上没有布满;在侵染15h.后,病斑开始在野生型拟南芥叶片上开始出现,而在其余转基因拟南芥叶片上没有出现。结果表明,在拟南芥的抗核盘菌反应中,SGT1和RAR1均参与到抗病反应机制中。为了进一步验证SGT1和RAR1两个基因的抗性作用,将病斑面积进行统计分析。在侵染15h.后pBI121-SGT1转基因拟南芥叶片的病斑面积最小;在侵染21h.后pBI121-RAR1-GUS转基因拟南芥叶片的病斑面积明显高于其他叶片的病斑面积,这种现象一直持续到病斑布满整个叶片。这些研究发现进一步证明SGT1和RAR1两个基因参与拟南芥的抗病反应。5.T2代转基因拟南芥与野生型拟南芥的SGT1和RAR1基因及相关的抗性基因的表达水平会有差异,将7个相关抗性基因的表达水平用荧光实时定量PCR进行实时监测,EDS1、NDR1、RPP5及LOX2在不同的转基因拟南芥中的表达量有差异,为SGT1、RAR1与相关的抗性基因的作用机制提供新的依据。
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