造血干/祖细胞（Hemotopoietic stem/progenitor cell,HSPC）具有自我更新和多向分化能力,在各种血液疾病和免疫缺陷疾病等的治疗中具有广阔的应用前景。脐血因其具有采集方便、来源广泛、细胞扩增能力强等优势成为HSPC的主要来源。由于单份脐血中含有的HSPC绝对数量不足以满足临床应用的需求,成为限制其临床应用的主要瓶颈。体外扩增是解决HSPC数量不足的主要方法。HSPC有不对称分裂、分化的对称分裂和自我更新的对称分裂三种分裂模式,选择自我更新的对称分裂才能增加HSPC数量。在体外扩增过程中HSPC不可避免的会分化为CD34-细胞,从而影响HSPC的体外扩增。为了探究并解决这一问题,本文首先探究了 CD34-细胞对HSPC体外扩增和分裂模式选择的影响。在此基础上采用在培养过程中通过定期富集CD34+细胞以及全换液,降低培养上清中TGF-β1浓度的策略,提高了选择自我更新对称分裂细胞的比例,促进了 CD34+细胞的扩增及生理功能的维持。分析了 TGF-β信号通路相关基因表达水平的变化,探讨CD34-细胞影响HSPC体外扩增的可能机制。并从强化AhR信号通路的抑制入手,联合AhR和TGF-β信号通路,进一步提高了体外扩增过程中选择自我更新对称分裂的HSPC 比例,在维持HSPC生理功能的基础上提高了 HSPC的体外扩增倍数,为建立优化的HSPC体外扩增过程提供了技术支持。本文采用无血清培养体系以脐血CD34+细胞为研究对象,设计了三组6个体外扩增条件探究了培养体系中CD34-细胞对HSPC细胞体外扩增和分裂模式选择的影响。结果发现体外扩增过程中CD34-细胞抑制HSPC的体外扩增,培养物中CD34-细胞比例与CD34+细胞扩增、CD34+CD38-细胞扩增和选择自我更新对称分裂的HSPC比例间存在准线性关系,线性方程分别为 Y=-1.132X+2.204、Y=-1.474X+2.695和Y=-0.3431X+1.361。此外,体外扩增过程中培养物中HSPC比例与选择自我更新对称分裂的HSPC 比例也存在准线性关系,线性方程为Y=1.894X-0.9724。为了减少培养物中CD34-细胞对HSPC体外扩增的影响,采用在CD34+细胞体外扩增过程中定期富集CD34+细胞去除CD34-细胞的策略。其中,对照组采用在第4天和第7天半量换液,定期富集CD34+细胞组在第4天和第7天定期富集CD34+细胞并全换液。结果发现培养至第10天,CD34+细胞的扩增倍数为10.75±2.75倍,显著高于对照组的7.15±1.10 倍（p＜0.05）。培养物中 CD34+CD38-细胞和原始 HSPC（CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+细胞,pHSPC）的比例及扩增倍数也显著高于对照组（p＜0.05）。选择自我更新对称分裂的HSPC 比例为38.85±4.49%,显著高于对照组的29.77±0.85%（p＜0.05）。通过分析扩增后HSPC的集落形成能力和二次扩增能力和功能相关基因的表达水平,发现定期富集CD34+细胞促进了扩增后HSPC生理功能的维持。进一步分析发现第10天时培养上清中的总TGF-β1和活化TGF-β1浓度分别为69.15±4.81 pg/mL和4.33±1.09 pg/ml,显著低于对照组的 625.54±58.76 pg/mL 和 313.07±12.81 pg/ml（p＜0.05）,TGF-β信号通路相关基因的表达也显著下调。综上所述,推测在培养过程中采用定期富集CD34+细胞策略可以通过降低培养上清中TGF-β1浓度,抑制TGF-β信号通路,提高选择自我更新对称分裂细胞的比例,促进CD34+细胞的扩增及生理功能的维持。由于培养过程中定期富集CD34+细胞延长了细胞处理时间,为此采用定期全换液的方式,减少细胞处理时间,并验证CD34-细胞通过分泌TGF-β1抑制HSPCs的体外扩增。结果发现,全换液组培养上清中TGF-β1的总浓度及活化浓度均显著低于对照组（p＜0.05）。而全换液组中总细胞扩增倍数、CD34+细胞和CD34+CD38-细胞及pHSPC的比例及扩增倍数、选择自我更新对称分裂的HSPC 比例均显著高于对照组（p＜0.05）。全换液策略也促进了扩增后HSPC生理功能的维持。进一步比较定期富集CD34+细胞和定期全换液两种策略HSPC的扩增效果后发现两种策略具有相同的HSPC体外扩增效果。可见,CD34-细胞分泌的TGF-β1是抑制HSPC体外扩增的关键因素。已有研究表明AhR信号通路的抑制可以显著提高HSPC的体外扩增。TGF-β信号通路处于激活状态也可以抑制AhR信号通路,而培养过程中采用定期富集CD34+细胞或定期全换液降低TGF-β1浓度的策略均抑制了 TGF-β信号通路,可能会减弱TGF-β信号通路对AhR信号通路的抑制作用。因此联合抑制AhR与TGF-β信号通路。在确定AhR信号通路抑制剂SR1添加策略为0.5 μM/12h的基础上,联合全换液策略体外扩增HSPC,结果发现培养至第10天,SR1+全换液组CD34+细胞扩增倍数为9.84±2.70倍,显著高于SR1组的7.27±2.24倍（p＜0.05）;选择自我更新对称分裂的HSPC 比例也显著高于SR1组（p＜0.05）。此外,采用添加SR1与全换液联用策略显著促进了扩增后HSPC生理功能的维持。可见,采用添加SR1与全换液联用策略提高了培养过程中选择自我更新对称分裂细胞的比例,促进了 CD34+细胞的扩增及生理功能的维持。采用添加SR1与定期富集CD34+细胞联用策略进一步验证HSPC的体外扩增效果。结果发现,培养至第10天,SR1+定期富集CD34+细胞组培养物中CD34+细胞扩增倍数为 28.91±5.98 倍,显著高于 SR1 组的 11.53±1.51 倍（p＜0.05）。SR1+定期富集 CD34+细胞组中选择自我更新对称分裂的HSPC 比例也显著提高（p＜0.05）。SR1+定期富集CD34+细胞组进一步加强了 SR1对AhR信号通路的抑制作用。此外,SR1+定期富集CD34+细胞和SR1+全换液也具有相同的HSPC体外扩增效果。由此,本文通过采用联合抑制AhR信号通路与TGF-β信号通路的策略进一步提高了培养过程中选择自我更新对称分裂细胞的比例,促进了 CD34+细胞的扩增及生理功能的维持。本文研究了 CD34-细胞对HSPC体外扩增的影响,并采用在培养过程中定期富集CD34+细胞或全换液降低培养上清中TGF-β1浓度的策略消除了 CD34-细胞对HSPC体外扩增的抑制作用,并通过联合抑制AhR和TGF-β信号通路提高了 HSPC的体外扩增效果。为进一步建立优化的HSPC体外培养过程及无血清培养基的开发提供了技术支持。