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糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病严重的微血管并发症之一。我国糖尿病患者DN患病率约33.6％，患者超过3800万。DN患者最终发展为终末期肾病的风险很高。 本实验室在前期的研究中发现二氢生物蝶呤还原酶(dihydropteridine reductase, QDPR)能够通过抑制TGFβ1/Smad3信号传导通路而延缓糖尿病肾病发生发展。糖肾方是临床上治疗DN有效的中药复方，在前期的动物与临床试验中已证实了其疗效。 目的： 本研究通过构建QDPR基因启动子及其逐段缺失重组质粒，对其核心调控区定位，分析其转录调控功能，从分子生物学角度探索QDPR基因在DN发病过程中的作用机制。此外，我们将研究糖肾方复方中药其是否通过上调QDPR启动子活性进而发挥作用。从分子水平探讨药物的作用机理，为进一步筛选具有增强QDPR启动子活性的中药或提取物奠定基础。 方法： 1.QDPR基因启动子核心调控区域的定位及研究 构建含有大鼠QDPR基因起始密码子（ATG）上游约的重组质粒2kb/pGL3。利用生物信息学软件对QDOR启动子2000bp片段进行预测与分析,发现ATG上游区域-529~-116内富含多种转录因子结合位点（transcription factor binding site，TEBS）。以2kb/pGL3为模板，构建保留-529~-1、缺失-529~-116片段的基因，将其插入萤光素酶报告基因载体 pGL3-basic上，命名D5’/pGL3、D1-4/pGL3。软件进一步分析-529~-116启动子片段，显示存在四个特异性蛋白1(Specificity protein, Sp1)TEBS，与共有序列的吻合度较高。分别对四个Sp1 TEBS依次进行缺失，构建四个缺失突变重组质粒，命名为D1/pGL3、D2/pGL3、D3/pGL3、D4/pGL3。将质粒瞬时转染HEK293T细胞，转染48h后收集细胞，采用Dual-Luciferase Reporter Assay试剂盒进行萤光素酶报告基因活性检测。读值采用spss统计软件进行数据分析。 2.糖肾方复方中药水提物对QDPR基因启动子活性的影响 QDPR启动子重组质粒转染入细胞后选择糖肾方复方中药水提物进行干预，从基因转录水平这一高起点分析药物干预可能的作用环节。步骤如下：制备糖肾方复方中药水提物，根据乳酸盐脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的实验结果确定中药干预的浓度范围为高中低三组浓度（800ug/ml、500ug/ml、50ug/ml）。转染构建好的各组重组质粒后给予不同的药物浓度刺激和设定不同的药物干预时间，收集细胞进行启动子活性检测。 结果： 1.QDPR基因启动子核心调控区域的定位：结果表明，与启动子2KB DNA片段相比，缺失QDPR基因起始密码子ATG上游-529~-116序列的萤光素酶活性只有原来的1%（P<0.01），而仅保留-529~-1序列的萤光素酶活性是原来的64%（P<0.05）。将QDPR基因上游-529~-116序列逐段缺失后发现，分别缺失-529~-429，-428~-250，-141~-116三段序列的萤光素酶活性都显著升高（P<0.01），而缺失-249~-142序列的萤光素酶活性则显著下降（P<0.05）。 2.LDH实验结果：糖肾方复方中药干预细胞实验的合理剂量为800 g/ml以下。高剂量的糖肾方复方中药（800 g/ml）在干预HEK293T细胞48h后能显著提高QDPR启动子2KB DNA片段的活性(p<0.01)。同时也能对D5’/pGL3、D3/pGL3、D4/pGL3启动子重组质粒的活性发挥作用（p<0.05）；但对D1-4/pGL3、D1/pGL3、D2/pGL3、pGL3组启动子活性没有影响（p>0.05）。 结论： 大鼠QDPR基因的启动子核心调控区位于起始密码子上游-529~-116区域内，该区域内存在潜在的正性调控区和负性调控区，其中-141~-116可能存在潜在的Sp1转录因子结合位点抑制启动子的转录活性。糖肾方复方中药可以提高QDPR基因启动子的活性，推测QDPR基因启动子是其药物作用的靶点之一。