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甘蓝型油菜细胞核雄性不育系Rs1046A和FM195A是从Yi3A转育而来的显性核不育系。前人的遗传分析研究显示,该不育系统的育性受到同一位点的三个复等位基因控制,这3个复等位基因分别为Bn MS5a(恢复基因),BnMS5b(不育基因)和BnMS5c(正常可育或临保系基因),且3个等位基因之间的显隐性关系为BnMS5a>BnMS5b>BnMS5c。为了阐明显性核不育的机制,我们通过图位克隆的方法获得了育性调控基因BnMS5。之后,对Bn MS5的表达模式、起源进化和不同等位基因的功能分化进行了详细的分析。结合细胞生物学和分子生物学方法研究显示,BnMS5a可能通过调节减数分裂染色体的浓缩使染色体维持正常的结构,从而保证减数分裂的顺利完成。主要研究结果如下:1.恢复基因BnMS5a的克隆通过筛选一个包含目的等位基因BnMS5a和BnMS5b的BAC文库,获得了BnMS5位点的物理图谱。结合之前研究获得的包含BnMS5c区段的序列,根据甘蓝型油菜参考基因组信息,对标记BE10和SCD8间的序列进行注释,比对不同等位基因的序列信息,选择其中一个在三个复等位基因中序列均有差异的基因作为候选基因。通过遗传转化实验确定来自于恢复系中的BnaA08g25920D可以恢复不育系的育性,即为目的等位基因BnMS5a。2.BnMS5等位基因的序列分析三个复等位基因的序列比对分析显示,BnMS5a和BnMS5c在编码区序列差异较小,仅有18个氨基酸的差异,但启动子区序列一致性仅为56.1%,差异极大。BnMS5b则为BnMS5a在第二个内含子区内MULE类转座子插入造成的功能缺失突变。蛋白序列分析发现,BnMS5编码一个功能未知的十字花科芸薹属特异蛋白,其N端有一个预测的Coiled-coil结构域,C端为一个DUF626结构域。3.显性核不育材料FM195A的染色体形态观察染色体展片结果观察FM195A减数分裂各时期染色体的形态特征发现,细线期后染色体的形态开始异常,染色体不能正常凝集而是相互靠近形成紧实的一团,减数分裂过程在细线期到偶线期的转换过程中停滞。4.BnMS5在减数分裂过程中的功能研究45S、5SrDNA和pAtT4探针荧光原位杂交检测结果显示,FM195A中同源染色体在减数分裂偶线期不能正常配对,没有观察到端粒的花束状结构。免疫荧光实验显示,FM195A中γH2AX信号与FM195B基本相同,表明DSB可正常形成;减数分裂染色体轴向元件关联蛋白ASY1可正常定位到FM195A染色体上,说明减数分裂前期I早期染色体蛋白轴的组装过程基本正常。而黏着蛋白(cohesin蛋白)SYN1及联会复合体中央元件重要组分ZYP1的定位受到严重影响,表明MS5是减数分裂特异的联会复合体组装所必需的;同时,HEI10信号也没有定位到突变体染色体上,表明MS5也是减数分裂同源重组所需的。5.BnMS5的表达分析qRT-PCR结果显示,BnMS5a和BnMS5c在油菜花蕾,茎和叶中均有表达。利用RNA原位杂交和GUS染色技术,我们检测了BnMS5a在油菜花药发育各个时期以及拟南芥各个组织中的表达状况。RNA原位杂交检测结果显示,BnMS5a在花粉母细胞时期花药壁以及小孢子母细胞中可检测到信号。GUS染色结果表明,BnMS5a在拟南芥各个组织中均有表达,其在花药中的表达模式与原位杂交的结果基本一致。BnMS5b由于在第二个内含子区转座子的插入,使得基因的表达量显著下降,RNA剪切异常,可以确定,BnMS5b是一个功能缺失基因型。转录和蛋白表达分析显示,MS5a的表达量最高,MS5c次之,MS5b最低。6.BnMS5基因的起源和进化分析分离白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中的同源基因发现,在油菜中除BnMS5外,还有两个同源基因:BnMS5-COPY2和BnMS5-COPY3。进化树和序列一致性分析表明BnMS5的两个有功能的等位基因BnMS5a和BnMS5c来源于白菜,而两个同源基因则来源于甘蓝。该基因只在芸薹属特异存在,是一个进化上新近产生的芸薹属特异的孤儿基因。