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结肠癌是当今现代化社会里严重影响人们健康的疾病，也是我国癌症引起死亡的主要因素之一。尽管介入性治疗和辅助性治疗方式取得了很大的进展，但对晚期患者仍无有效的治疗措施。因此，人们对化学药物预防结肠癌寄予了厚望。近年来，肿瘤学研究领域一个引入注目的进展是，人们发现非甾体类抗炎药(NSAIDs)通过抑制环氧合酶(COX)可延缓或预防某些癌症(如结肠癌)的发生与发展。因此，COX与肿瘤的关系成为近期人们研究的热点。COX是催化花生四烯酸(AA)转化为前列腺素(PGs)过程中的关键酶。一般认为COX有两种同工酶：COX-1和COX-2，二者在结构上非常相似，但是它们在机体中的表达方式及功能却完全不同。COX-1通常表达于许多正常组织细胞中，对维持胃肠道粘膜的完整性起着重要作用。COX-2是一个诱生型酶，可被细胞因子、生长因子和肿瘤促进剂等多种因素诱导表达。传统的NSAIDs通过抑制COX-2发挥其抗炎作用，但同时抑制COX-1而导致严重的胃肠道副作用，如胃肠道出血及溃疡。因此，COX-2选择性抑制剂成为NSAIDs研究领域的一个新方向。大量的流行病调查学研究发现，长期服用阿司匹林等NSAIDs可降低结肠癌的发病率40-50％。动物的体内外实验也证实COX-2选择第四军医大学傅士学位论文性抑制剂可抑制结肠腺瘤的生长及发展，并诱导肿瘤细胞凋亡，但其作用机制尚不清楚。 本研究采用人结肠癌细胞系SW- 1 1 16、SW-480为对象，通过观察COX一2选择性抑制剂塞来昔布对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响，及其分子机制的研究，探讨塞来昔布诱导结肠癌细胞凋亡的信号转导途径;据此，本实验采用人结肠癌细胞系sw- 1 116体外筛选了本实验室新近合成的9个毗陛类COX一2选择性抑制剂的抗癌活性，并观察其中活性最高的PC407对SW- 1 116细胞增殖及凋亡的影响。 1.塞来昔布对人结肠癌SW‘1 116细胞系增殖与凋亡的影响及其机制本实验首次采用细胞系sw- 1 116研究阿司匹林及COX一2选择性抑制剂塞来昔布对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响，并探讨其分子机制。采用免疫组织化学法检测COx一2在sw- 1 116细胞的表达;利用MTT比色法检测药物对细胞生长活力的影响;通过叮陡橙(AO)荧光染色法观察凋亡细胞的形态学改变;用AnnexinV-FITC用I双标记流式细胞术检测细胞凋亡率;用流式细胞仪PI单染色法分析细胞周期变化:用免疫印迹(western blot)检测细胞色素c(cytc)的释放及半肤天冬酶(caspse一3)的活化。结果表明，阿司匹林及塞来昔布均可抑制结肠癌细胞的增殖并诱导其凋亡;塞来昔布比阿司匹林更为有效。但塞来昔布抑制细胞增殖的浓度远大于其抑制COX一2活性浓度，提示COX抑制剂有可能通过COX一2非依赖性途径诱导细胞凋亡。其机制可能与刺激线粒体释放Cytc，活化easPase一3促进细胞凋亡相关。 2.塞来昔布对人结肠癌S、v闷80细胞系增殖与凋亡的影响及其机制采用免疫组织化学法检测COx一2在人结肠癌细胞SW-480的表达;利用MTT比色法检测药物对细胞生长活力的影响;通过电子透射电镜法观察凋亡细胞的形态学改变;用DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡水平;用流式细胞仪PI单染色法第四军医大学博士学位论文分析细胞周期变化;用免疫印迹法(叭怂stem blot)检测Cyt。的释放及easpse一3的活化。结果表明，Cox一2在SW-48o细胞表达缺失，COX抑制剂诱导细胞凋亡存在COX一2非依赖性途径，塞来昔布通过刺激线粒体释放Cyt。，活化casPase一3促进细胞凋亡。本研究结果发现COX抑制剂可通过COX一2非依赖性途径诱导细胞凋亡。 3.塞来昔布诱导结肠癌细胞翻亡的信号转导途径实验通过免疫组织化学法结合计算机图象分析检测突变型p53、PZlwAFI/cIP’、抑凋亡基因bcl一2及凋亡基因bax在人结肠癌细胞SW-川6及SW-480中的表达。结果表明，塞来昔布通过降低突变型p53的表达，使野生型p53功能增强，上调pZ 1 wAF’‘Cl”，使大量细胞停滞于GI/G。期，启动凋亡基因bax表达，促使细胞凋亡。提示COX抑制剂诱导结肠癌细胞凋亡可能是其预防结肠肿瘤的作用机制之一。 4.新型毗哇类cox一2选择性抑制剂对人结肠癌细胞Sw一1116增殖及凋亡的影响本实验采用M竹比色法，通过人结肠癌SW一1 116细胞系对本实验室合成的9个新型毗吟类COX一2选择性抑制剂的细胞活力抑制作用进行体外筛选;用细胞计数法观察PC407对Sw- 1 116细胞生长曲线的影响;通过AO荧光染色法及电子透射电镜法观察凋亡细胞的形态学改变;用流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双标一记流式细胞术检测细胞凋亡率与药物浓度的关系:用流式细胞仪PI单染色法分析细胞周期变化与时间的关系:用DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡水平。结果表明，9个新型毗哇类COX一2选择性抑制剂均以不同程度抑制结肠癌细胞的增殖，且抑制作用强于阿司匹林。PC407抑制细胞生长的IC50为16.6土0.17pmol/L，是塞来昔布xCso浓度的一半(33.6士l.78pmol/L)，其对细胞的抑制作用显著强于塞来昔布:PC407抑制SW- 1116细胞增殖、诱导细胞凋亡呈时效及量效依赖性。提示第四军医大学博士学位论文COX一2选择性抑制是一类具有潜力的结肠癌预防药。