论文部分内容阅读
目的:伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）是起源于B细胞非霍奇金淋巴瘤的一个特殊亚型，为来源于滤泡生发中心细胞的高度恶性肿瘤。其肿瘤细胞倍增时间短、侵袭性高，临床上给予大剂量化疗可使部分患者治愈。近年来，利妥昔单抗、自体造血干细胞移植等治疗手段的临床应用于治疗伯基特淋巴瘤使预后有所改善，但仍有部分患者难以治愈，急需寻找更为有效的治疗手段。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACi）以表观遗传为治疗靶点，可通过调节细胞组蛋白和非组蛋白的乙酰化水平而调控基因的表达，产生细胞周期阻滞、诱导凋亡等多种生物学效应，从而抑制肿瘤细胞增殖，并可以增强肿瘤对一些化疗药物的敏感性。蛋白酶体抑制剂通过特异性抑制泛素-蛋白酶体通路，阻断蛋白酶体对蛋白的水解，从而阻滞肿瘤细胞生长及血管生成，进而发挥其抗肿瘤作用，其毒副作用较小，且与常规化疗药物无交叉耐药性，可以抑制多种实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤的增殖。近年来，关于两类靶向药物联合治疗套细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、急性T淋巴母细胞白血病及多发性骨髓瘤研究较多，提示两药联合应用在血液系统恶性肿瘤疾病中有良好的前景。但两药联合应用于人伯基特淋巴瘤细胞株生长调控的基础研究国外偶有报道，国内尚未见相关报道。本实验通过研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米（bortezomib）对人伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞生长调控的影响，探索其作用机制，以期为临床治疗提供理论基础和实验数据，寻找伯基特淋巴瘤新的治疗手段。方法:1人伯基特淋巴瘤细胞株raji细胞培养、传代人伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞培养于含体积分数为10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI1640培养液中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2条件的培养箱中培养，48-72h传代一次。此时细胞生长良好，悬浮成团，台盼兰染色拒染率95%以上。本研究相关实验均采用对数生长期Raji细胞进行。2MTT法检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589、蛋白酶体抑制剂硼替佐米及两药联合作用于Raji细胞对细胞增殖的影响2.1LBH589抑制Raji细胞增殖实验取Raji细胞悬液，调整细胞密度约为2×105/ml，以每孔90μl接种于U型96孔板，随机分为对照组和LBH589实验组。对照组加入等体积培养液，实验组分别加入LBH589并使其终浓度为1nM、10nM、102nM、103nM、104nM，对照组及LBH589实验组均设3个复孔。置于细胞培养箱中孵育，分别于加入药物后第24、48、72h向各孔中加入20μl的MTT（5mg/ml）溶液，继续孵育4h，后离心培养板，吸去上清，向各孔中加入150μl二甲基亚砜，振荡器振荡至结晶充分溶解。调整酶标仪至570nm条件下，测量各组吸光度值。2.2硼替佐米抑制Raji细胞增殖实验取Raji细胞悬液，调整细胞密度约为2×105/ml，接种96孔板，随机分为对照组、硼替佐米实验组。对照组加入等体积培养液，实验组分别加入终浓度为2nM、4nM、8nM、16nM、32nM硼替佐米，余同上述方法。2.3LBH589+硼替佐米抑制Raji细胞增殖试验取Raji细胞悬液，以约2×105/ml的密度接种96孔板，随机分为对照组、LBH589组、硼替佐米组、LBH589+硼替佐米联合用药组，于加药后第24h、48h、72h测量各组吸光度值。3流式细胞术AnnexinⅤ/PI标记法检测LBH589、硼替佐米及两药联合作用于Raji细胞对细胞凋亡率的影响取Raji细胞悬液，随机分为对照组、LBH589组、硼替佐米组和LBH589+硼替佐米组，培养箱中孵育36h，后收集细胞，预冷（4℃）PBS洗涤，向各管内加入5μlAnnexinⅤ/FITC及10μl碘化丙碇（PI），混匀后于室温避光孵育15分钟，使用流式细胞仪上机检测各组Raji细胞凋亡率。4流式细胞术检测LBH589、硼替佐米及两药联合作用于Raji细胞对Fas蛋白表达率的影响取Raji细胞悬液，随机分为对照组、LBH589组、硼替佐米组和LBH589+硼替佐米组，培养36小时后收集细胞，预冷（4℃）PBS洗涤，加入Fas抗体，室温、避光反应1小时后加入二抗，应用流式细胞仪上机检测Raji细胞Fas蛋白的表达率。5流式细胞术检测LBH589、硼替佐米及两药联合作用于Raji细胞对bcl-2蛋白表达率的影响取Raji悬液细胞，随机分为对照组、LBH589组、硼替佐米组和LBH589+硼替佐米组，培养36小时后收集细胞，预冷（4℃）PBS洗涤，加入bcl-2抗体，室温、避光反应1h后加入二抗，应用流式细胞仪上机检测Raji细胞bcl-2蛋白的表达率。6Realtime-PCR检测LBH589、硼替佐米及两药联合作用于Raji细胞对NF-κB的mRNA表达水平的影响取Raji细胞悬液，随机分为对照组、LBH589组、硼替佐米组和LBH589+硼替佐米组，培养36小时后收集细胞，根据RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒具体实验步骤检测NF-κB的mRNA表达水平。7Western blot法检测LBH589、硼替佐米及两药联合作用于Raji细胞对NF-κB（p65）蛋白表达水平的影响。取对数生长期Raji细胞，随机分为对照组、LBH589组、硼替佐米组和LBH589+硼替佐米组，培养36小时后收集细胞，提取各组细胞的总蛋白，取100μg蛋白上样、SDS-PAGE电泳。印迹转膜后，加入抗NF-κB（p65）抗体孵育，后加入二抗，用显色剂显色成像。结果:1MTT法检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589、蛋白酶体抑制剂硼替佐米及两药联合作用于Raji细胞对细胞增殖的影响1)人伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞经不同浓度（1nM、10nM、100nM、1000nM、10000nM）LBH589作用24h、48h、72h后，应用MTT法检测各标本吸光度值均有不同程度减低，LBH589对Raji细胞株有抗增殖活性。相同处理时间条件下，随着LBH589浓度的增加，Raji细胞抑制率逐渐升高；相同浓度LBH589条件下，随着处理时间的延长，Raji细胞抑制率逐渐升高。对于Raji细胞，LBH589作用时间与浓度对抑制率均有影响，其效应具有时间-剂量依赖性。2)Raji细胞经不同浓度（2nM、4nM、8nM、16nM、64nM）硼替佐米作用24h、48h、72h后，应用MTT法检测各标本吸光度值均有不同程度减低，硼替佐米对Raji细胞株有抗增殖活性。相同处理时间条件下，随着硼替佐米浓度的增加，Raji细胞抑制率逐渐升高；相同浓度硼替佐米条件下，随着处理时间的延长，Raji细胞抑制率逐渐升高。对于Raji细胞，硼替佐米作用时间与浓度对抑制率均有影响，其效应具有时间-剂量依赖性。3)当LBH589和硼替佐米联用时，Raji细胞抑制率明显升高，如Raji细胞经10nM LBH589、4nM硼替佐米、10nMLBH589+4nM硼替佐米处理24h后，细胞抑制率依次为（7.53±3.02）%、（10.15±2.83）%、（26.74±2.80）%，两药联用可以协同抑制Raji细胞的增殖。2流式细胞术AnnexinⅤ/PI标记法检测LBH589、硼替佐米及两药联合作用于Raji细胞对细胞凋亡率的影响：在一定浓度范围内，LBH589单药或硼替佐米单药均可以诱导Raji细胞凋亡，且随着提高药物浓度后细胞凋亡率有所升高。当LBH589和硼替佐米联合作用于Raji细胞时，细胞凋亡率明显增加。3流式细胞术检测LBH589、硼替佐米及两药联合作用于Raji细胞对Fas蛋白表达率的影响：与对照组相比，LBH589单药可上调Raji细胞Fas蛋白的表达率，而硼替佐米单药处理Raji细胞的Fas蛋白表达率无明显变化。4流式细胞术检测LBH589、硼替佐米及两药联合作用于Raji细胞对Bcl-2蛋白表达率的影响：与对照组相比，LBH589单药或硼替佐米单药均可下调Raji细胞bcl-2蛋白的表达率，当两药联用时，表达率明显下调。5Realtime-PCR方法检测LBH589、硼替佐米及两药联合组作用于Raji细胞后NF-κB mRNA表达水平变化：在一定浓度范围内，LBH589单药或硼替佐米单药均可下调NF-κB mRNA的表达水平，且随药物浓度增加NF-κB mRNA表达水平下调，两药联用时，作用明显增强。6Western Blot法检测LBH589、硼替佐米及两药联合作用于Raji细胞后NF-κB（p65）蛋白表达的影响：LBH589单药或硼替佐米单药均可下调NF-κB（p65）蛋白的表达，当两药联用时，作用明显增强。结论:1在一定的浓度范围内，组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589可以抑制伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞的增殖、诱导细胞凋亡，机制可能与上调Fas蛋白、下调bcl-2蛋白和NF-κB（p65）蛋白的表达相关。2在一定的浓度范围内，蛋白酶体抑制剂硼替佐米可以抑制人伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞的增殖、诱导细胞凋亡，机制可能与下调bcl-2蛋白和NF-κB蛋白的表达相关。3在一定的浓度范围内，组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米可以协同抑制人伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞的增殖，诱导细胞凋亡，机制可能与下调bcl-2和NF-κB蛋白的表达相关。