论文部分内容阅读
目的：口服核苷（酸）类似物（nucleot(s)ide analogs, NAs）是目前持久抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的主要药物，NAs治疗后乙型肝炎复发的问题越来越引起广泛重视。HBV在体内以准种的形式分布和存在，准种多态性对停药后复发患者再治疗的疗效及病情转归有重要影响。目前，对NAs治疗停药后复发再治疗的研究主要集中于拉米夫定，对于阿德福韦酯等其他NAs的研究较少。国内临床研究仅提示使用阿德福韦酯规范化治疗停药复发的慢乙肝患者再次使用阿德福韦酯仍然有效，而对于复发患者体内乙肝病毒准种构成的研究则未见报道。本研究以单用阿德福韦酯规范化治疗停药复发的慢性乙型肝炎患者和未经过抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者为研究对象，全面分析阿德福韦酯规范化治疗停药后复发患者体内病毒准种的准确构成；对比停药复发患者与未抗病毒患者体内病毒准种构成的差异，为阿德福韦酯规范化治疗停药后复发患者的再治疗提供病毒学依据。方法：收集阿德福韦酯规范化治疗停药后复发的慢乙肝患者及未抗病毒治疗的慢乙肝患者的血清，提取HBV-DNA；采用巢式PCR扩增HBV多聚酶的逆转录区（reverse transcription. RT）基因，一部分PCR扩增产物送至上海Life technology公司直接测序，另一部分PCR扩增产物继续行琼脂糖凝胶水平电泳，以分离目的DNA片段；胶回收纯化目的DNA片段，将其连接到T载体上，转入处于感受态的TOP10大肠杆菌中；X-gal-IPTG-AMP-LB琼脂平板筛选阳性克隆，每个样本挑取30个阳性克隆，过夜培养后的菌液送至上海Life technology公司测定T载体上插入的目的DNA片段序列；测序结果由DNASTAR SeqMan拼接去除无关序列，以进行进一步的序列分析，包括去除载体序列、多序列比对、找出耐药突变位点、计算准种复杂度和准种多样性、进化树分析等；采用SPSS19.0对结果进行统计分析。结果：1．停药复发组（n=25）与未抗病毒组患者（n=16）的乙肝病毒准种中野生株的比例均大于93.33%，野生株均为优势株。停药复发组中含有耐药突变的克隆与野生克隆之比为10/740，未抗病毒组中含有耐药突变的序列与野生序列之比为8/472，卡方检验得出P>0.05，两组间的差异无统计学意义。2.停药复发组与未抗病毒组的准种复杂度Sn分别为0.974(0.044)和0.922(0.081)，P>0.05，两组间准种复杂度的差异无统计学意义。停药复发组与未抗病毒组的准种多样性（d、dS、dN）比较， P值分别为0.171、0.237、0.197，均大于0.05，两组间准种多样性差异无统计学意义。3.对慢性乙型肝炎患者的准种复杂度及准种多样性（d、dS、dN）与血HBV-DNA水平进行Spearman秩相关分析，结果显示准种复杂度及准种多样性与血HBV-DNA水平无相关性。4.所有样本中检测到的已知耐药突变位点有：耐恩替卡韦的rtI169T、rtS202I、rtM250V，耐拉米夫定的rtV173L、rtL180M、rtM204I/V，耐替比夫定的rtM204I，耐阿德福韦酯的rtA181V，未检测到rtT184G、rtN236T突变。在未抗病毒组的患者的血清中也能检测到如下已知的耐药突变：rtI169V、rtA181V、rtS202I、rtL180M、rtM204I/V。仅在未抗病毒组患者的血清中检测到1个含有阿德福韦酯耐药突变（rtA181V）的克隆。5.巢式PCR扩增的RT基因直接测序的结果中未发现已知耐药突变位点的存在,均为野生株序列；而巢式PCR扩增RT基因TA克隆后测序的结果中发现上述多种已知耐药突变的存在。6.停药复发组患者与未抗病毒组患者在进化树中并无明显聚集特征，序列间遗传距离相近，均小于0.04。结论：1.使用阿德福韦酯规范化治疗后停药复发的慢乙肝患者体内准种中的优势株仍为野生株，与未抗病毒治疗的慢乙肝患者在准种复杂度和多样性上并无统计学差异。停药复发患者再次使用阿德福韦酯治疗仍然有效。2.未行任何抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者体内仍然存在耐药突变株；TA克隆后测序与直接测序相比能更好的了解体内病毒的组成及是否存在耐药突变。