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支气管哮喘是以气道高反应性、气道慢性炎症及气道重建为特征的慢性疾病。气道重建可导致不可逆的气道阻塞和持续性的气道高反应性[1-3],它包括上皮下胶原沉积,黏液细胞增生/化生,平滑肌的增生和肥厚等,是目前难治性哮喘的重要病理基础之一。已有研究证实气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cell, ASMC）的增殖是气道重建（airway remodelig）的关键环节,ASMC作为气道重建的主要成分,通过自身的异常增殖参与整个过程[4-6]。因此,探讨支气管哮喘ASMC的异常增殖的调控机制是研究支气管哮喘气道重建发生机制的重要方向,抑制ASMC的异常增殖可成为治疗难治性哮喘的重要思路。但既往的研究多集中在探讨各种生物刺激（如生长因子、细胞因子等）对ASMC功能的影响及最终产生的生物学效应,有关生物信息在ASMC内传递机制的研究则相对较少。细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）通道是一种重要的细胞内信号转导通道,联系着细胞外信号与细胞核反应间的信息转导,参与多种细胞异常增殖与分化的信号调控[7]。ERK是该通道中的关键酶,它有多种亚型,在平滑肌细胞中主要为ERK1、ERK2（ERK1/2）两种亚型分布。研究表明,在探讨血管重建机制的研究中发现,ERK1/2通道是介导血管平滑肌细胞（VSMC）异常增殖的重要信号通道[8]。它参与调控VSMC的表型变化、迁移、增殖、凋亡和分泌等活性[9,10]。那么,哮喘气道重建中是否也存在血管重建中的类似机制,即哮喘ASMC内ERK1/2的活性是否也介导了ASMC异常增殖生物信号转导?目前国内外尚少见研究报道。本实验拟通过建立大鼠慢性哮喘模型,体外培养ASMC,探讨哮喘ASMC增殖活性的变化及ERK1/2在该增殖变化中的作用,从细胞内信号转导的角度研究ERK通道在哮喘ASMC增殖调控中的意义,为进一步阐明哮喘气道重建的病理生理学机制提供理论依据,为寻求更为有针对性的治疗方法提供实验依据。研究内容:1.建立大鼠慢性哮喘模型,病理图像分析慢性哮喘大鼠气道重建,免疫组化法检测ERK和增殖细胞核抗原（PCNA）在肺内表达,激光共聚焦显微镜分析ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK）和PCNA在气道平滑肌上共表达,免疫印迹检测气道平滑肌上ERK和PCNA蛋白的表达,原位杂交检测气道平滑肌中ERK和PCNA的mRNA表达,从而探讨ERK是否在慢性哮喘大鼠气道平滑肌上表达。2.建立大鼠慢性哮喘模型,体外培养哮喘ASMC,以ERK激动剂表皮生长因子（EGF）和抑制剂PD98059作为工具药物,采用流式细胞仪、四甲基偶氮唑盐（MTT）法、3H-TdR掺入法、PCNA免疫组织化学观察ASMC的增殖,免疫细胞化学法检测细胞周期蛋白（cyclin） D1和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）2表达,逆转录-聚合酶链测定（RT-PCR）和Western免疫印迹检测ERK mRNA和ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达。从而探讨哮喘ASMC增殖活性的变化及ERK1/2在该增殖变化中的作用。3.体外培养哮喘ASMC,以ERK激动剂表皮生长因子（EGF）和抑制剂PD98059作为工具药物,用原位末端标记法和Annexin-V FITC PI双染色法观察ASMC凋亡,免疫细胞化学法检测凋亡相关基因bcl-2和bax的表达,用Western免疫印迹检测半胱天冬酶（caspase）-3蛋白的表达。从而探讨哮喘ASMC凋亡变化及ERK1/2在该凋亡变化中的作用。4.设计合成ERK反义寡核苷酸（ODN）,体外培养哮喘ASMC,利用脂质体将正义、反义及错配ERK1 ODNs导入ASMC,用流式细胞仪、MTT法、3H-TdR掺入法检测不同寡核苷酸对ASMC增殖的抑制作用,原位末端标记法和Annexin-V FITC PI双染色法检测细胞凋亡变化,RT-PCR和Western免疫印迹检测ERK mRNA和ERK1/2、p-ERK1/2、PCNA蛋白的表达。观察反义核酸对哮喘ASMC增殖和凋亡的干预。结果:1.病理图像分析显示慢性哮喘大鼠有气道平滑肌层增厚,出现结构重建。免疫组化法检测显示ERK和PCNA在肺内表达增强,激光共聚焦显微镜分析ERK1/2、p-ERK1/2和PCNA在气道平滑肌上共表达,免疫印迹和原位杂交检测显示在气道平滑肌上有ERK和PCNA蛋白与mRNA表达增加。2.与对照组ASMC比较,哮喘组ASMC的G0/G1期所占细胞的比例明显减少,S + G2/M期细胞所占比例增高,吸光度值( A490 )、细胞DNA合成量、PCNA阳性表达量、cyclin D1和CDK2蛋白表达量均明显增加。与对照组ASMC比较,哮喘组ASMC的ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达量以及ERK活化率（%）均显著增高。经PD98059干预之后,哮喘组ASMC的S + G2/M期细胞所占比例、A490值、细胞DNA合成量、PCNA阳性表达量、cyclin D1和CDK2蛋白表达量明显降低,ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达量以及ERK活化率（%）均显著下降。经EGF干预之后,哮喘组ASMC的S + G2/M期细胞所占比例、A490值、细胞DNA合成量、PCNA阳性表达量、cyclin D1和CDK2蛋白表达量进一步增高,而这一作用可以被PD98059所抑制。3.与对照组ASMC比较,哮喘组ASMC凋亡指数、早期凋亡细胞百分率明显下降,ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达量以及ERK活化率（%）亦显著增高。经PD98059干预之后,哮喘组ASMC的凋亡指数与早期凋亡细胞百分率、bax蛋白表达量和caspase-3蛋白含量明显增高,ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达量以及ERK活化率（%）亦显著降低。经EGF干预之后,哮喘组ASMC凋亡指数与早期凋亡细胞百分率进一步下降,而这一作用可以被PD98059所抑制。4.反义ODNs组的G0/G1期所占细胞的比例明显增高,S + G2/M期细胞所占比例明显减少,A490值、细胞DNA合成量、PCNA蛋白表达量、ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达量以及ERK活化率（%）均明显减少,与哮喘组各值比较差异均有显著性（P<0.05）。反义ODNs组的凋亡指数和早期凋亡细胞百分率明显增高,与哮喘组各值比较差异均有显著性（P<0.05）。而正义和错配ERK1 ODNs没有上述作用。结论:1.慢性哮喘大鼠有气道平滑肌层增厚,出现结构重建。慢性哮喘大鼠气道重建模型复制成功;2.慢性哮喘大鼠中ERK和PCNA在肺内表达增强,同时在气道平滑肌上有ERK和PCNA蛋白与mRNA表达增加。提示ERK可能是介导慢性哮喘气道重建中平滑肌增殖的重要信号通路之一。3.慢性哮喘ASMC内源性增殖`活性增加,同时ERK1/2表达及活化率均显著增强。ERK1/2通过诱导cyclinD1和CDK2蛋白高表达,使细胞从G1期向S期发展,细胞增殖。ERK信号通道在哮喘气道重建的ASMC增殖调控中具有重要作用。4.慢性哮喘组大鼠ASMC内源性增殖活性增加的同时,伴有凋亡活性下降。ERK1/2参与慢性哮喘ASMC凋亡调控,其机制与bcl-2家族和caspace-3有关。5.反义ERK1 ODNs可通过抑制ERK mRNA表达和翻译来抑制慢性哮喘大鼠ASMC的增殖,促进其凋亡。由此可见,ERK1/2信号通道是介导哮喘ASMC异常增殖的重要信号通道,对哮喘ASMC增殖与凋亡起调控作用。ERK信号通道可能通过细胞周期、bcl-2家族以及caspace-3对哮喘ASMC增殖与凋亡起调控作用。这为研究哮喘气道重建的发病机理提供新的理论,也为将来治疗难治性哮喘提供一定的新思路。