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研究背景:原发性肝细胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）（下文以肝癌代称）,从全球范围来看,其发病率和死亡率分别处在第五和第四位,是消化系统比较常见、后果较为严重的疾病之一。HCC发生的危险因素包括病毒感染、酒精过量、黄曲霉素及代谢相关脂肪性肝病等多种因素,过去的几年间,人们在肝癌诊断和治疗方面飞速进步,但并未有效的改善预后效果,所以揭示出HCC的发生和发展的具体机制,确定更合适的分子标志物是我们的研究方向。随着高通量测序技术的飞速发展,越来越多的研究表明长链非编码RNA（lncRNA）参与肝癌的发生及发展,但具体的作用机制还有待深入的研究。研究目的:利用生物信息学软件及TCGA等数据库筛选出与肝癌预后相关的目标lncRNA,并分别在细胞及临床样本中进行验证,分析目标基因的表达与临床病理参数及预后的相关性,进一步探讨目标lncRNA MYLK-AS1在肝癌细胞中的生物学功能及参与肝癌发生发展的具体机制。研究方法:第一部分:利用TCGA公共数据库筛选出与肝癌预后相关的mRNA、miRNA及LncRNA。1.下载TCGA数据库中肝癌相关的RNA数据及临床资料,建立基因表达矩阵,分别提取mRNA、miRNA、lncRNA。用R 3.4.3软件做差异分析,找出差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA。2.通过miRcode、starbase、Target Scan、miRTar Base等数据库获得lncRNA-miRNA调控关系和miRNA-mRNA调控关系,利用Cytoscape v3.6构建ceRNA调控网络。3.结合Kaplan-Meier生存分析筛选出与生存预后相关lncRNA。4.运用q RT-PCR检测技术,了解预测的lncRNA在正常肝细胞和肝癌细胞系中的表达水平。第二部分:通过q RT-PCR检测44例配对原发性肝癌组织和癌旁非癌组织中长链非编码RNA MYLK-AS1的表达情况,分析其表达和各项病理参数之间的关联。然后运用原位杂交技术,检测72例原发性肝癌组织和20例癌旁非癌组织中MYLK-AS1表达情况,揭示出MYLK-AS1和病例的病理TNM分期、肿瘤分化程度、血管浸润、肿瘤标志物AFP等临床特征及预后的相关性,接着利用单/多因素回归分析,分析与肝癌预后的独立危险因素。最后通过荧光原位杂交技术（FISH）检测MYLK-AS1在肝癌细胞中的表达定位情况。第三部分:从分子层面着手,揭示出长链非编码MYLK-AS1在肝癌发生和发展过程中扮演的角色。1.首先设计合成MYLK-AS1的siRNA干扰序列和过表达质粒,分别在Huh7和Hep G2细胞中转染MYLK-AS1-siRNA和MYLK-AS1过表达质粒（MYLK-AS1-pc DNA）,通过CCK-8增殖、克隆形成、裸鼠皮下成瘤实验以及流式分析技术研究MYLK-AS1对肝癌细胞生物学功能的影响。2.通过q RT-PCR技术分析MYLK-AS1与miR-141-3p在肝癌细胞中的相互调控作用,采用双荧光素酶报告实验检测MYLK-AS1与miR-141-3p的结合情况。3.在肝癌细胞中分别或共同转染MYLK-AS1与miR-141-3p,通过流式分析技术明确二者共表达和肝癌细胞周期及凋亡之间的关系,利用Western blot检测靶基因CDC25A及细胞周期Rb/E2F通路中关键蛋白分子的表达情况。研究结果:1.通过TCGA数据库肝癌与正常肝组织RNA数据的下载及分析,筛选出肝癌中差异表达的基因,1992个mRNA,1082个lncRNA和126个miRNA;利用miRcode、star Base和miRTar Base预测lncRNA-miRNA和miRNA-mRNA的关系对,建立相互调控的ceRNA网络;Kaplan-Meier生存分析筛选出与预后相关的lncRNA13个,mRNA20个。选出4个高表达且与预后负相关的lncRNA,利用q RT-PCR在肝癌细胞系中进行验证,发现MYLK-AS1在肝癌细胞系中表达高于正常肝细胞,因此将MYLK-AS1作为目标研究基因进行进一步的功能研究。2.q RT-PCR检测表明:44例HCC组织中MYLK-AS1的表达明显高于癌旁组织（p=0.0268）,具体的表达水平和病理TNM分期（p=0.022）、肿瘤分化程度（p=0.049）正相关;72例肝癌组织原位杂交结果表明,HCC组织和非癌组织中MYLK-AS1均有表达,但肝癌组织中MYLK-AS1染色评分更高,且MYLK-AS1表达高低除了与TNM分期及肿瘤分化程度相关,还受到血管浸润及患者生存时间的影响。多因素回归分析结果表明:MYLK-AS1的表达和肿瘤大小是HCC预后的独立危险因素（p=0.015,p=0.012）。3.荧光原位杂交（FISH）结果显示MYLK-AS1在肝癌细胞Huh7及肝癌组织样本中均主要在细胞的胞浆表达。4.CCK-8增殖检测、克隆形成和小鼠成瘤实验显示,MYLK-AS1会加速肝癌细胞的增殖;流式细胞周期及凋亡检测实验显示,在Huh7细胞中沉默MYLK-AS1,加速HCC细胞凋亡,细胞周期停滞在某个阶段;提高Hep G2细胞内MYLK-AS1的表达水平,HCC细胞增殖加速,细胞的凋亡受阻,并且MYLK-AS1通过激活Rb/E2F信号通路促进细胞周期进程。5.miR-141-3p在肝癌细胞及肝癌组织中低表达,MYLK-AS1与miR-141-3p存在互相调控作用,双荧光素酶报告实验证实MYLK-AS1与miR-141-3p存在结合。6.CDC25A为miR-141-3p的靶基因,CDC25A在肝癌组织中表达增高,且其表达量与MYLK-AS1呈正相关,在肝癌细胞中miR-141-3p负向调控CDC25A的表达;细胞功能回复实验显示miR-141-3p可以减弱MYLK-AS1对CDC25A表达的调控及对细胞周期的影响。研究结论:1.本研究通过生物学软件及TCGA等公共数据库筛选出肝细胞肝癌中差异表达的mRNAs、lncRNAs及miRNAs,并构建相互调控的ceRNA网络,结合数据库中患者的临床资料确定对肝癌预后效果具有影响作用的lncRNA MYLK-AS1;2.肝癌细胞和组织内,MYLK-AS1表达水平异常升高,和肿瘤TNM分期、分化程度、血管浸润及预后之间有着紧密的关联,MYLK-AS1的表达水平以及肿瘤的大小为患者预后的独立危险因素,这表明MYLK-AS1在肝癌的进展过程中发挥致癌作用,同时可作为肝癌预后评估的分子标志物;3.MYLK-AS1通过促进肝癌细胞的增殖、细胞周期进展及抑制细胞凋亡等生物学行为在肿瘤的发生发展中发挥作用;4.MYLK-AS1与miR-141-3p存在结合,并且MYLK-AS1竞争结合miR-141-3p调控靶基因CDC25A的表达,激活Rb/E2F信号通路促进细胞周期进展。该研究的发现为肝癌发生发展的具体机制提供新的思路及研究基础。