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目的:先天性肛门直肠畸形是最常见的消化道畸形,与胚胎期后肠发育障碍有关,而卵母细胞、胚胎及胎儿的发育均受到卵母细胞的成熟度及质量影响。卵母细胞从生发泡（germinal vesicle,GV）期进入到生发泡破裂（germinal vesicle break down,GVBD）期的过程被称为双线期阻滞释放。GVBD是卵母细胞成熟的标志,是保证减数分裂顺利完成和胚胎正常发育的重要过程。以前的研究已经证明蛋白激酶Bα（Protein Kinase Bα,PKBα/Akt1）对卵母细胞双线期阻滞的释放有促进作用,并且Calmodulin（CaM）和蛋白激酶Cδ（PKCδ）对PKBα/Akt1有调控作用。因此CaM和PKCδ在卵母细胞双线期阻滞释放期间的调节对于调控正常胚胎发育过程以及先天畸形形成可能起了重要作用,然而关于它们对卵母细胞双线期阻滞释放期间的调控机制并不十分清楚。由于小鼠卵母细胞是脊椎动物里与人类胚胎最接近的简单而天然的细胞周期模型,然而使用小鼠卵母细胞研究胚胎调节机制及先天畸形的报道一直很有限。本研究我们使用小鼠建立了卵母细胞成熟的体外培养模型（从GV到GVBD期）。我们首先检测了小鼠胚胎常用的培养液M2或M16在卵母细胞双线期阻滞释放期间对小鼠卵母细胞的生存率及细胞形态的影响。由于本研究使用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）作为CaM和PKCδ抑制剂溶解试剂,因此我们也探究了不同浓度的DMSO对卵母细胞双线期阻滞释放和生存率的影响。最后在矿物质油封M2培养环境与合理DMSO浓度下使用CaM抑制剂Calmidazolium chloride和PKCδ抑制剂Sotrastaurin分别处理细胞,我们检测了CaM,PKCδ（Thr505）和pCaMKII（Thr286）的表达及定位的改变,分析了CaM和PKCδ对小鼠卵母细胞双线期阻滞释放的影响及二者的相互作用关系。我们的研究工作对于理解正常胚胎发育的调控机制及胚胎发育异常导致的先天性肛门直肠畸形具有重要的理论及临床应用意义。研究方法:1、检测M16和M2培养液对卵母细胞GVBD发生的影响:在本研究中,我们首先收集GV期卵母细胞,随机分为60组（每组30个细胞）,在显微镜下将60组卵母细胞随机置入M16,矿物质油封M16和矿物质油封M2培养微滴中（每种培养微滴各20组）,置于37℃、5%CO2培养箱内培养4 h。显微镜下观察统计每组卵母细胞生存率及形态改变。2、检测不同浓度DMSO对卵母细胞GVBD发生的影响:取分离的GV期卵母细胞,随机分为30组,每组50个,在显微镜下将细胞随机置入含0%、1%和2%DMSO的M2培养微滴中（每种浓度各10组）,置于37℃、5%CO2培养箱内培养4 h。显微镜下观察统计每组卵母细胞的生存率及GV期和GVBD期卵母细胞的数量。3、使用CaM抑制剂Calmidazolium chloride和PKCδ抑制剂Sotrastaurin处理GV期卵母细胞检测对pCaMKII（Thr286）的影响:比较处理组与对照组卵母细胞进入GVBD期的百分比,并检测pCaMKII（Thr286）的表达及定位改变。4、检测CaM与pPKCδ（Thr505）在小鼠卵母细胞在双线期阻滞释放期间的相互作用关系:使用CaM抑制剂Calmidazolium chloride处理细胞后,检测pPKCδ（Thr505）表达及定位改变;使用PKCδ抑制剂Sotrastaurin处理细胞并检测CaM的表达。结果:1、矿物质油封M2组的卵母细胞的生存率高于矿物质油封M16培养组和M16培养组,且矿物质油封M2微滴培养的卵母细胞形态更完整。2、对照组、1%DMSO组和2%DMSO组对小鼠卵母细胞在双线期阻滞期间的生存率无影响,2%DMSO对卵母细胞双线期阻滞释放有促进作用。3、Calmidazolium chloride处理细胞后,GVBD期卵母细胞的百分比和pCaMKII（Thr286）表达水平下降,免疫荧光结果显示处理组pCaMKII（Thr286）的定位较对照组发生改变;Sotrastaurin处理细胞后,pCaMKII（Thr286）表达水平下降。免疫荧光结果显示处理组pCaMKII（Thr286）的定位较对照组发生改变。4、Calmidazolium chloride处理细胞后,pPKCδ（Thr505）表达下降,免疫荧光结果显示处理组pPKCδ（Thr505）蛋白定位较对照组发生改变,反之用Sotrastaurin处理细胞后CaM表达水平不变。结论:1、在卵母细胞从GV期发育到GVBD期间,矿物质油封M2微滴培养的卵母细胞比矿物质油封或非油封M16液滴培养的卵母细胞生存率更高,细胞形态更佳。2、1%和2%浓度的DMSO不会影响卵母细胞的生存率,但是2%浓度的DMSO能促进卵母细胞双线期阻滞的释放。3、下调CaM抑制了小鼠卵母细胞双线期阻滞的释放和pCaMKII（Thr286）的表达;下调pPKCδ（Thr505）抑制了pCaMKII（Thr286）的表达,暗示了CaM/pPKCδ（Thr505）可能参与了pCaMKII（Thr286）的调节。4、下调CaM,pPKCδ（Thr505）的表达下降,反之下调pPKCδ（Thr505）,CaM的表达不变。表明CaM可能是pPKCδ（Thr505）的一个上游调节因子。对卵母细胞双线期阻滞释放期的培养技术和蛋白调控方面的研究对理解正常胚胎发育的调控机制及胚胎发育异常导致的先天性肛门直肠畸形具有重要的理论及临床应用意义。