论文部分内容阅读
研究背景卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤,其发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中排列第三位,但死亡率却位居首位。患者早期无明显自觉症状,临床缺乏特异性的有效诊断方法,超过70%的患者初次就诊时就已经是晚期。这也是卵巢癌治疗效果差,复发率和死亡率高的重要原因。因此寻找一个敏感的肿瘤标记物及潜在的治疗靶点对于提高卵巢癌临床治疗疗效具有重要的意义。EPS8 (epidermal growth factor receptor pathway substrate 8, EPS8),表皮生长因子受体(EGFR)通路底物8,是一种广泛表达的多域信号转导蛋白,在进化过程中高度保守。有资料显示其在线虫、果蝇、非洲蟾蜍以及人类细胞中均有表达。人类EPS8的编码基因定位于12号染色体长臂2区3-4带,含有大约821个氨基酸,其相对分子量为97KD。有研究表明,在胚胎形成过程中,原始细胞向特异性神经外胚层和身体器官的选择性分化,以及细胞的增殖、多形应答可能都与EPS8的表达有关。1999年,Alvarez等人实验发现,在有丝分裂信号通路中有EPS8蛋白的存在。EPS8调控细胞的分化、增殖的生物学特性为其参与肿瘤细胞的发生、发展提供了分子生物学的依据。许多研究数据显示,EPS8在胰腺癌、食管鳞癌、腺癌、口腔鳞癌、宫颈鳞癌、大肠癌等多种恶性肿瘤中表达明显增高,与肿瘤进展以及化疗的敏感程度密切相关[14-18]。有专家认为,可以通过EPS8蛋白的检测,作为判断肿瘤复发及预后的参考指标。那么,EPS8蛋白在卵巢癌的发生、发展中起到了什么作用?目前国内外研究仍未阐明。本实验以卵巢癌手术石蜡切片及卵巢癌细胞为研究对象,采用S-P免疫组化法、实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测卵巢癌组织及细胞中EPS8蛋白的表达,分析其表达水平与卵巢癌临床病理因素之间的相关性；其次,以p113.7质粒为载体,成功构建了p113.7-EPS8 shRNA重组质粒,为进一步研究EPS8基因对卵巢癌生物学行为的影响提供了有效技术手段；最后,以卵巢癌细胞株SKOV3作为研究对象,观察p113.7-EPS8 shRNA重组质粒转染后卵巢癌细胞的生长增殖、细胞周期及其对顺铂敏感性的变化,进一步探索EPS8基因对卵巢癌生物学行为的影响。目的1.观察EPS8蛋白在卵巢癌手术石蜡切片中的表达；2.观察EPS8蛋白在卵巢癌不同细胞株中的表达；3.统计分析EPS8蛋白表达水平与卵巢癌临床病理因素之间的相关性；4.构建p113.7-EPS8 shRNA重组质粒,观察p113.7-EPS8 shRNA转染前后卵巢癌细胞生长增殖、细胞周期、顺铂敏感性等生物学行为的变化。方法及内容1.免疫组化法检测76例卵巢上皮性癌组织、15例上皮性卵巢良性肿瘤组织及15例正常卵巢组织石蜡切片中EPS8的表达。2. RT-PCR检测卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、8910、8910/PM中EPS8的mRNA水平的表达情况。3. Western Blot检测卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、8910、8910/PM中EPS8的蛋白水平的表达情况。4.利用重组质粒技术构建p113.7-EPS8 shRNA重组质粒并进行测序鉴定。5.选取EPS8蛋白表达较高的卵巢癌细胞株SKOV3,应用siRNA技术沉默EPS8蛋白的表达后,检测P113.7-EPS8 shRNA对SKOV3细胞的生长增殖、细胞周期、顺铂敏感性等生物学行为的影响。结果1.免疫组化结果表明,卵巢癌组织中EPS8蛋白均有不同程度的表达,细胞学定位主要为胞浆。在中晚期(Ⅲ+Ⅳ)卵巢癌患者中EPS8蛋白高表达的比例低于早期(Ⅰ+Ⅱ)卵巢癌患者,有统计学差异(38.2%vs.66.7%,p<0.05)。淋巴结转移的卵巢癌患者中EPS8蛋白高表达的比例低于无淋巴结转移的卵巢癌患者(37.7%vs.65.2%,p<0.05)。此外,本研究数据表明,卵巢癌患者中EPS8蛋白表达水平与卵巢癌病理类型、细胞分化程度无显著相关性(p>0.05)。2.EPS8在不同卵巢癌细胞株中表达水平不同,A2780、SKOV3、8910细胞中表达水平较高,在8910/PM细胞中表达水平最低。在后续试验中,选择EPS8表达水平较高的SKOV3作为研究对象。3.利用重组质粒技术构建p113.7-EPS8 shRNA重组质粒,测序鉴定序列正确,Western Blot检测结果表明,随着p113.7-EPS8 shRNA重组质粒转染时间的延长,EPS8蛋白表达水平显著下降。4.MTT法检测SKOV3细胞生长曲线显示,p113.7-EPS8 shRNA转染后SKOV3细胞生长曲线较Empty vector转染组和空白对照组显著减慢,提示EPS8蛋白表达降低对SKOV3细胞生长有抑制增殖的作用。5.流式细胞仪检测各组细胞周期结果显示,p113.7-EPS8 shRNA重组质粒转染后,G0/G1期比例显著增高,S期比例显著下降,提示EPS8蛋白表达下降能降低SKOV3细胞的DNA合成。6.MTT法检测P113.7-EPS8 shRNA重组质粒转染后卵巢癌SKOV3细胞顺铂敏感性的变化结果表明,空白对照组和空质粒组的IC50值分别为32.18μM和34.87μM,而P113.7-EPS8 shRNA重组质粒转染后卵巢癌SKOV3细胞的IC50值为14.17μM,即EPS8蛋白表达降低后,SKOV3细胞对顺铂的敏感性提高了约2.46倍。结论1.EPS8蛋白在卵巢上皮性癌组织中表达较高,主要分布于细胞质中。对临床病理因素的统计分析表明,卵巢癌组织中EPS8蛋白与卵巢癌疾病进展相关。2. p113.7-EPS8 shRNA重组质粒特异性降低EPS8的表达水平后,显著抑制卵巢癌SKOV3细胞的生长增殖速度。3. pll3.7-EPS8 shRNA重组质粒特异性降低EPS8的表达水平后,能引起卵巢癌SKOV3细胞G0/G1期阻滞。4. p113.7-EPS8 shRNA重组质粒特异性降低EPS8的表达水平后,显著提高SKOV3细胞对顺铂的敏感性。