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白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）是一种多功能的细胞因子，它能够抑制白血病细胞，如HL-60、U937、M1等的增殖。LIF的生物学效应是通过结合靶细胞膜上的LIF受体完成的。LIF首先与LIF受体α亚基（gp190）结合，并使之与另一受体亚基β亚基（gp130）结合形成异源性二聚体，从而启动细胞内信号转导使胞外的信号传入核内，调控特定基因的表达，使细胞产生一系列的生理和病理变化。研究LIF的胞内信号转导对了解LIF发挥生物学功能的分子机制有重要意义。在LIF抑制白血病细胞的增殖的过程中，JAK-STATS通路是LIF产生活性的重要途径，而在众多的STATS中STAT3的激活与白血病细胞的分化关系最为密切，LIF抑制白血病细胞增殖与JAK1和STAT3的激活的关系也已被确定。有关LIF与有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）p42/44的关系，在1994年被Schiemann证实。然而，LIFR两个亚基在启动JAK-STATS途径以及MAPK p42/44的激活中，进而在抑制白血病细胞的增殖中各自有何作用？对这一问题，学者们观点不一。因而，有必要对白血病抑制因子两个亚基在启动信号中的作用做进一步的研究。研究LIF在白血病细胞的信号启动，对了解白血病细胞的分化、增殖异常机理及其调控机制，为白血病的临床治疗提供基础理论依据有重要意义。 本研究利用pAlter突变系统，通过基因重组技术将两受体亚基细胞内区互换构建了两个嵌合受体亚基基因130/190和190/130：130/190由gp130的细胞外区、跨膜区和gp190的细胞内区组成；190/130由gp190的细胞外区、跨膜区和gp130的细胞内区组成。在此基础上，将130/190和190/130装入真核表达载体pEDα，构建了表达载体pED130/190和pED190/130，并用 第二军医大学硕士学位论文 脂质体转染法将其转入HL－60细胞内，并使之分别在HL－60细胞内成功表 达。在LIF 的诱导下，HL60细胞内形成受体亚基细胞内区同源性二聚体 190＊卜190＊t和门0叮卜130。yi：转染昨D13o门go的＊L6o细胞，在＊F的 诱导下，因存在数量上的优势，130／190取代HL－60细胞膜上的野生受体亚 基 gp 30并同另一野生受体亚基 gp 90一起与 LIF结合，所以，受体复合 物的细胞外区仍由一个gp 30和一个gpl90组成，而细胞内区则由gpl90 的细胞内区同源性二聚体启动信号转导；同理，转染pED 90／1 30的HL七0 细胞，则由gp 30细胞内区二聚体传递LIF的信号。通过检测同源性二聚 体引发信号转导后的 HL－60细胞内的 JAK 磷酸化水平、STAT3磷酸化水 平、MpPKp42几4磷酸化水平以及白血病细胞的增殖状况，观察gpl90和 gp 30亚基在LIF引发的信号转导中及其在白血病细胞增殖和分化中各起何 作用。 首先，我们采用免疫沉淀的方法获得 HL60细胞内总 JAK 蛋白，利用 磷酸化抗体通过免疫印迹杂交的方法检测了野生型、转染130／190、转染 190／130三组细胞 LIF诱导前后的 JAKI的磷酸化水平，结果显示：JAKI的 磷酸化水平在LIF诱导后的野生型细胞组和转染130／190的细胞组较各组诱 导前及190／130组诱导后高。采用免疫组化方法检测了LIF诱导omin、smin、 10min、15min、20min、30min后的三组细胞的 STAT3 Tyr705磷酸化水平， 并用生物显微图象分析系统量化染色结果，绘制了STAT3磷酸化水平与LIF 诱导的时间依赖性曲线，结果显示：野生组和130／190组细胞的STAT3磷 酸化水平smin起上升，10min时达到顶点，15min时开始下降，20min、30min 基本恢复诱导前水平，而190／130组变化趋势不明显。我们还采用免疫印迹 杂交技术对＊F诱导 10min后的三组细胞的 SM3 Tyr705磷酸化水平进行 了检测，结果显示：130／190组最高，野生组次之，190／！30组最低。利用 免疫印迹杂交技术检测了LIF诱导6h后的三组细胞的STAT3的表达水平， 结果显示：野生组和130／190组STAT3较190／130组高。实验表明：gpl90 的细胞内区同源性二聚体具有了与野生型 LIF 受体相同的激活 JAK 和 STAT3的作用。 Jiklm1lSbo．w－－－OfHiedyya’l’1EmbryOlyy．twndMilharyMwhcalUaive’sityShenpe2（XX33 4 第二军医大学颀士学位论文 同样，我们利用免疫组化方法检测了 LIF 诱导 omin、smin、10min、 15min、20min、30min后的三组细胞的MAPKp42／44 Thr202 Tyr204磷酸化 水平，并用生物显微图象分析系统量化染色结果，绘制了MAPK磷酸化水 平与LIF诱导的时间依赖性曲线，结果发现：LIF诱导10min后，190／130