产Monacolin K红曲霉的筛选及其发酵条件的研究

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从1979年日本学者远腾章发现红色红曲霉(M. ruber)产生强降胆固醇物质Monacolin K之后,国内外学者掀起了降脂红曲霉的研究热潮,对红曲霉功能因子的分子结构和安全性等方面进行了广泛而深入的研究,它的药用价值开始逐渐得到人们的重视。1987年美国默沙东(MERCK)开发出新一代降胆固醇的药物美降之,随后美国和日本又开发出一系列的他汀类药物。但是我国对降脂红曲霉的研究相对落后,1996年我国才首次生产洛伐他汀原料药及其片剂。目前我国降胆固醇功能红曲霉的生产还是普遍存在产量偏低、生产成本偏高等问题。究其原因,一方面是培养工艺的不足,另一方面是缺乏优良的红曲霉菌株。因此进行红曲霉菌株的筛选研究具有非常重要的现实意义。本实验对高产Monacolin K的菌株进行了筛选,并对Monacolin K的检测条件,红曲霉M32菌株的发酵条件进行了研究。 试验结果如下: 1.建立了高效液相色谱法对Monacolin K进行定量分析。选用色谱柱:Kromasil C185um,250*46;柱温为35℃;检测波长238nm;流动相:V(甲醇):V(水)=87:13,流速为1ml/min,样品经0.45um有机膜过滤后用HPLC测定。该方法对Monacolin K的测定具有良好的线性关系,重现性好,相对标准偏差和平均回收率分别为0.3896、99.23%。 2.从60个样品中分离到45株红曲霉,其中产Monacolin K的红曲霉菌株有9株,其中M32菌株产生Monacolin K最多,其余36株菌产生少量或不产生Monacolin K。 3.本实验对筛选的红曲霉菌株M32进行了菌落形态观察,并进行了红曲霉M32菌株的生理特性试验,结果表明,红曲霉M32菌株的生长温度范围为:25—35℃;孢子萌发和菌丝生长最适的起始pH范围为:4.0-6.5;而且其孢子耐酒精浓度能力较强,最高耐酒精浓度达14%。 4.通过单因素和正交实验确定了红曲霉M32液态发酵的培养基组成,还发现在培养基中添加适量硫酸镁、硫酸锌和玉米粉可以提高发酵液中Monacolin K的含量。对红曲霉M32菌株产Monacolin K的培养基进行了进一步优化,确定了其最佳的培养基配方:甘油90g/l,大米粉水解液20g/l,蛋白胨10g/l,硝酸钠5g/l,MgSO4.7H2O1g/l,ZnSO4.7H2O2g/l,KH2PO42.5g/1。最佳发酵条件为:培养温度:25℃,起始pH:5.0,500ml三角瓶装液量为200ml,摇床转速:150r/min,发酵培养12天。用最佳发酵培养基和最佳发酵条件进行深层液态发酵,最终发酵液中MonacolinK的产量为700一soomg/l。
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