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糖尿病是由于胰岛β细胞胰岛素分泌或作用缺陷而导致的慢性疾病,病程晚期往往伴有致命并发症。其中2型糖尿病发病机制复杂,迄今尚未阐明,现有药物尚无法治愈糖尿病,因此深入探索胰岛β细胞分化及胰岛素分泌功能调控新靶点与相关分子机制,是2型糖尿病防治及药物研究亟待解决的热点问题之一。β细胞外葡萄糖经线粒体代谢产生ATP,关闭ATP敏感性钾(KATP)通道诱发细胞膜去极化,使胞外Ca2+经由电压门控Ca2+通道(voltage-gated Ca2+ channels, VGCC)内流,并放大胞浆Ca2+信号,分别从KATP通道依赖以及非依赖两条途径促进β细胞内胰岛素释放,这一过程为葡萄糖刺激的胰岛素分泌(Glucose stimulated insulin secretion, GSIS).线粒体功能完备是胰岛素释放的重要前提,线粒体功能下降导致的GSIS不足为2型糖尿病发病特征。正常的GSIS功能需要ATP与Ca2+信号共同维持,因此本论文试图从线粒体代谢及Ca2+信号角度出发,探索GSIS过程中尚未阐明的调控靶点,希望为2型糖尿病发病机制研究及药物治疗提供新的思路。β细胞胰岛素分泌同时也受Ca2+信号调控。细胞内钙库内质网上Ca2+通道兰尼碱受体(Ryanodine Receptor,RyR)、三磷酸肌醇受体(Inositol 1,4,5-triphosphate receptor,IP3R)、肌浆(内质)网Ca2+-ATP酶(Sarcopkasmic/ Endopkasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA),以及钙库操控性Ca2+内流(Store-operated Ca2+ entry, SOCE)均可通过调节胞浆Ca2+浓度,参与调控β细胞胰岛素分泌。Junctophilins(JPs)是一类存在于可兴奋细胞中的膜结合蛋白,可连接细胞膜与内质网膜形成膜连接复合物(Junction Membrane Complexes, JMCs),加强细胞内外Ca2+信号交流,维持胞内Ca2+平衡。JP家族蛋白(JP1-JP4)分布具有组织特异性。JP缺失破坏JMCs结构引起胞内Ca2+紊乱,也可在特异分布相应组织作为功能蛋白受微环境改变引起应激反应,与多种人类疾病密切相关。β细胞具有可兴奋细胞的电活动及Ca2+瞬变特征,但迄今尚未见有关JPs在β细胞表达及功能研究的报道,亟需加紧探索并力图阐明与2型糖尿病可能的关系。内质网与线粒体经由线粒体融合蛋白(Mitofusin 1, Mfh1; Mitofusin 2, Mfn2)形成并置结构,促进内质网内Ca2+经由IP3R快速穿梭进入线粒体,点燃三羧酸循环,加速线粒体内ATP生成。JP敲除可引起线粒体形态及功能受损,使Mfn2表达下调,其机制不明。提示JMCs不仅是细胞膜与内质网连接的结构基础,也可能调控内质网与线粒体连接。因此,本论文第一部分从考察JPs在人与小鼠胰岛p细胞中表达,探索JP亚型对小鼠p细胞ATP依赖的GSIS, Ca2+信号以及线粒体-内质网连接的调节作用,并力图论证其内在机制。本论文第二部分(附)关注线粒体能量代谢相关信号通路在干细胞治疗糖尿病中的可能学术价值与应用前景。体内成体干细胞可分化为胰岛素阳性细胞,为糖尿病治疗提供新的思路,同时诱导性多潜能干(induced pluripotent stem, iPS)细胞不仅可基因干预,还避免了伦理、免疫排异等问题,其问世为细胞移植治疗带来曙光。胚胎干(embryonic stem, ES)细胞同样具有多能性,在一定条件下可定向分化成为胰岛素阳性(Insulin-positive, INS+)细胞,寻找合适的靶点定向调控ES细胞分化功能完整的INS+细胞,有望用于促成体干细胞分化,为抗糖尿病药物提供新的靶点,并为iPS细胞在糖尿病细胞治疗研究提供借鉴。过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)为线粒体代谢脂质传感器,参与脂肪酸氧化磷酸化是干细胞分化开关。迄今PPARs对多能干细胞定向分化为INS+细胞的调控尚不明确。课题组前期结果显示PPARβ激活可促进正常线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, ΔΨm)形成,推进小鼠ES细胞分化,与INS+细胞形成相关,但PPARβ激活对诱导细胞GSIS功能的研究及相关分化机制仍不明确。胰十二指肠同源异性盒蛋白(Pancreatic and duodenal homeobox 1, Pdx-1)在胚胎发育过程中调节β细胞生成,并参与调控p细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌(Glucose stimulated insulin secretion, GSIS) 。叉头框蛋白O1 Forkhead box protein O1, Foxol)和葡萄糖合成激酶3β(Glycogen synthase kinase-3β, Gsk3β)在p细胞中均可抑制Pdx-1表达。在INS+细胞分化过程中,PPARβ激活与上述信号分子的关系尚不明确。因此,本论文第二部分探索了线粒体代谢脂质传感器PPARP激活与小鼠ES细胞分化为功能完整INS+细胞与GSIS的相关机制,论证了PPARP激活在人类ES细胞分化为INS+细胞过程中的作用。1. Junctophilin3调控胰岛β细胞胰岛素分泌功能研究本论文第一部分考察了JPs在人与小鼠胰岛p细胞中表达,并探索了JP对小鼠β细胞GSIS的调控作用及相关机制。实验结果显示JP3在小鼠与人胰岛p细胞中有表达。在原代小鼠胰岛中干扰JP3后,GSIS功能受损,伴随线粒体ΔΨm, ATP产量以及线粒体Ca2+瞬变下降,但未激活线粒体依赖的细胞凋亡通路。与此同时,干扰JP3可选择性抑制RyR活性,减弱咖啡因诱导的胞浆Ca2+瞬变,而未激活内质网应激相关蛋白。本研究发现小鼠胰岛p细胞中存在细胞膜-内质网-线粒体超微结构,干扰JP3可选择性抑制Mfn2调节因子过氧化物酶体增殖物激活受体Y辅激活子α(Peroxisome proliferator-activated receptor y coactivator 1α, Pgc-1α)核转移,同时下调Pgc-1α转录,导致Mfn2表达下降。由此破坏内质网与线粒体并置结构,使内质网内Ca2+无法快速从IP3R穿梭进入线粒体,而降低葡萄糖刺激的ATP产量,导致ATP依赖的GSIS功能受损。本研究同时也发现人胰腺组织JP3选择性附着于RyR2,极有可能参与GSIS过程Ca2+信号放大,从而涉及GSIS的KATP通道非依赖调控环节。此外尚发现人胰β细胞核内同时表达Pgc-1α与PPARβ,提示极有可经能由Ca2+信号介导共同参与调控Mfn2,与线粒体功能及胰岛素释放密切相关。2. PPARβ激活促胰岛素阳性细胞分化机制研究(附)本论文第二部分探索了线粒体代谢脂质传感器PPARP激活对人类与小鼠ES细胞分化为GSIS功能完备INS+细胞的调节作用及相关机制。实验结果显示PPAR激活可促进INS+细胞分化并增强其GSIS功能。在小鼠ES分化为INS+细胞过程中,PPARP激活促进Pdx-1表达,特异性增加胰岛β样细胞分化。Foxo1为Pdx-1负调节因子,本实验发现在INS+细胞分化过程中,PPARβ激活经由PI3K/Akt信号转导,使胞浆p-Foxo1增加,而抑制Foxo1入核活化。为探索PPARβ激活调节INS+细胞分化的潜在临床研究意义,本部分考察了PPARβ激活在人类ES细胞分化过程中的作用,实验结果显示PPARβ激活同样增加INS+细胞的生成及GSIS功能,伴有PI3K/Akt/Foxo1/Pdx-1通路激活。结论：1.本文第一部分揭示了JP3在小鼠与人胰岛p细胞中有表达。在原代小鼠胰岛中JP3参与调控GSIS,并维持p细胞细胞膜-内质网-线粒体轴完整性。小鼠胰岛干扰JP3后,减弱RyR介导的Ca2+瞬变,抑制Pgc-1α核转移,使下游蛋白Mfn2表达下调,破坏线粒体与内质网连接结构,降低葡萄糖刺激的ATP产量,导致ATP依赖的GSIS功能受损。抑制小鼠胰岛p细胞JP3表达,并不引起线粒体依赖凋亡或内质网应激信号,提示JP3下调主要影响p细胞功能。尚揭示了人胰腺组织JP3选择性附着于RyR2,极有可能涉及GSIS的KATP通道非依赖调控环节；人胰β细胞核内同时表达Pgc-1α与PPARβ,极有可能共同参与调控Mfn2与胰岛素释放密切相关。所获结果有利于从全新的角度深入理解胰岛β细胞生理功能,为2型糖尿病防治及药物研究提供全新的切入点。2.本文第二部分(附)论证了PPARβ激活可促进人类及小鼠ES细胞分化为INS+细胞,并增强该INS+细胞的GSIS功能。PPARβ为脂质传感器,其激活促进线粒体脂质氧化磷酸化,经由PI3K/Akt通路调节p-Foxo1/Foxo1状态,抑制Foxo1活性而增加Pdx-1表达,由此促GSIS功能完备的INS+细胞生成。所获结果有望促成体干细胞分化,为发现潜在的抗糖尿病药物提供新的靶点,也可为诱导性多潜能干细胞糖尿病治疗应用基础研究提供有益的借鉴。