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催乳素(prolactin, PRL)是一种多肽类激素,具有促进乳腺发育、启动并维持泌乳的功能。PRL的生理功能主要通过PRLR-JAK/Stat5信号通路介导,而PRL、PRLR、Stat5a、Stat5b基因是介导乳腺发育及乳汁分泌信号通路所必须的因子。Stat5a和Stat5b均为PRL的胞内信号传导因子,两者间可形成同源或异源二聚体,调节靶基因的表达。研究发现,在PRL对乳腺的调控过程中,Stat5a是主要的胞内信号传导蛋白,参与调控乳腺细胞增殖与分化,但对其具体调控机制尚不清楚。为了探讨通过乳腺特异性表达外源PRL基因提高转基因水牛奶品质或奶产量的可行性,本研究首先构建并筛选了乳腺特异性表达PRL基因载体,建立了转PRL基因小鼠模型并对其进行了分析鉴定。同时,通过寻找转录因子Stat5a的靶基因,探讨了其调控乳腺细胞增殖与分化的作用机理。一、乳腺特异性表达PRL基因载体构建为筛选得到适用于体细胞核移植和原核注射的乳腺特异性表达PRL转基因载体,采用加有His标签和凝血酶识位点的特异性引物,通过RT-PCR方法从成年雌性水牛垂体组织中扩增得到不含信号肽的长804bp的PRL基因片段。以在KpnI和SacI位点插入有BCNpolyA序列的pMD18-T载体为骨架,依次连接插入PRL基因、酪蛋白(BCN)启动子(3.8BCN或5.2BCN)、标记或筛选基因元件(cmv-EGFP-SV40polyA-SV40polyA、cmv-EGFP-SV40 polyA-SV40-neo-SV40polyA或cmv-EGFP-IRES-neo-SV40 polyA)3个片段,构建获得5个乳腺特异性表达水牛PRL基因的载体。将5个载体分别瞬时转染Bcap37细胞,分析各载体在细胞水平上外源基因的表达情况。结果显示,除p3.8BCN-PRL-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40polyA-SV40-neo-SV40 polyA载体外,其余4个载体均可在Bcap37细胞中表达外源PRL基因。细胞转染样品Western Blot分析发现,5.2BCN载体的PRL蛋白表达水平高于3.8BCN载体。考虑到不同转基因动物制备方法的需要,选择p5.2BCN-PRL-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40 polyA载体备用于原核注射法生产转基因小鼠模型,选择适于细胞筛选的p5.2BCN-PRL-BCNpolyA-cmv-EGFP-IRES-neo-SV40polyA载体为核移植法用转基因载体结构。二、乳腺特异性表达PRL基因小鼠模型的建立与分析将p5.2BCN-PRL-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40polyA载体进行线性化处理后,通过原核注射法将质粒注入到FVB小鼠受精卵内,共获得8只携带有外源基因的首建鼠。活体荧光及爪尖荧光检测结果显示,部分小鼠可观察到明显的绿色荧光信号。PRL和cmv片段的PCR扩增结果显示,部分小鼠可扩增得到长752 bp的PRL基因片段以及长599 bp的cmv启动子片段；Southern Blot进一步验证了PCR检测为阳性的小鼠基因组中整合有外源基因。繁殖的部分F2代小鼠,在长波UV灯下部分小鼠发出明显的绿色荧光。外源基因拷贝数的Q-PCR分析结果发现,UV灯下有明显绿色荧光的小鼠外源基因拷贝数达到十个以上,无明显荧光小鼠的拷贝数仅为2个。外源基因整合位点的Gene Walking检测结果显示,有明显绿色荧光小鼠的外源基因插入位点上下游20kb附近不存在其他基因。以上结果表明,采用原核注射法可生产转PRL基因的小鼠,且外源基因在转基因小鼠后代中可稳定地遗传。对转基因小鼠中外源PRL蛋白表达情况、表达PRL对转基因小鼠泌乳及安全性的影响进行了进一步分析。转基因小鼠主要脏器组织的WesternBlot分析发现,外源PRL蛋白仅在小鼠乳腺及乳汁中表达。ELISA分析结果显示,转基因小鼠乳汁中PRL蛋白含量为611.74-2773.96μIU/ml,是野生型小鼠的77.92～706.80%倍；平均含量为769.24μIU/ml,是野生型小鼠的223.73%倍。QRT-PCR分析发现,转基因小鼠乳腺中乳蛋白(CSN2)和乳糖(B4galtl)基因表达水平显著上升(P≤0.01)。ELISA法分析血清中PRL蛋白含量结果显示,泌乳期转基因小鼠血清中PRL蛋白含量显著高于野生型(≤0.01),非泌乳期无显著差别。转基因小鼠平均产仔数与野生型相比不存在显著差异(P≥0.05)。以上结果表明,外源PRL基因仅在转基因小鼠乳腺特异性表达,其表达可在泌乳期促进乳腺中乳蛋白和乳糖相关基因的表达,且对转基因小鼠的生存和繁殖性能无不良影响。三、转录因子Stat5a靶基因的筛选与分析为寻找与小鼠乳腺发育相关转录因子Stat5a的靶基因,在利用QRT-PCR分析Stats在乳腺不同发育时期表达结果的基础上,采用ChIP-seq和RNA-seq方法对妊娠后期野生型小鼠(16天,G-NC)、妊娠后期转PRL基因小鼠(16天,G-PRL)和泌乳期转PRL基因小鼠(7天,L-PRL) 3个样本进行了深入分析,构建了G-NC VS G-PRL、G-PRL VS L-PRL 2个对比组。ChIP-seq数据中,3个样本均得到了25M以上的Reads,其中唯一定位的Reads有20M以上,占总Reads的78%以上。G-NC、G-PRL和L-PRL3个样本扫描分别得到218、234和160个Peaks,平均Peak长度约1 kb。GO分析发现,Peaks相关基因在生物过程方面主要与细胞过程、代谢过程、组织信号过程等关系最为紧密；在分子功能方面,主要与结合、催化活性、分子传导活性等关系密切。RNA-seq测序后,每个样本均得到11M以上的Reads,其中唯一定位的Reads有8M左右,数据分析发现测序量达到饱和、Reads覆盖度高、随机性好,得到了良好的RNA-seq数据。表达差异基因分析发现,与G-NC相比,G-PRL样本中有253个基因表达上调,414个基因表达下调；与G-PRL相比,L-PRL样本中有157个基因表达上调,2180个基因表达下调。对表达差异的基因进行GO分析发现,在生物过程方面,2个对比组表达差异的基因均主要与细胞过程、代谢过程、生物调控等关系最为紧密,在分子功能方面,均与结合、催化活性、分子传导活性等关系最为密切,该结果与ChIP-seq数据分析中Peaks相关基因的GO分析结果基本一致,由此说明,转录因子Stat5a的结合与其结合位点相关基因的表达水平密切相关。对ChIP-seq和RNA-seq数据进行联合分析,共发现10个受Stat5a调控的靶基因。G-PRL与L-PRL样本数据对比发现,Stat5a在小鼠妊娠后期与Erbb4、Tnfrsf13c、Gabrp、Arrdc4、Pvt1、AI848285基因的靶位点结合并上调这些基因的表达;Stat5a在妊娠后期与Lgr6、Ptprv基因的靶位点1结合,上调这些基因表达,在泌乳期与靶位点2结合,下调这2个基因表达。G-NC与G-PRL样本数据对比发现,妊娠后期,野生型小鼠的Stat5a与Ceacam2和Atp2b2基因的靶位点1结合,下调了基因的表达；外源PRL的表达使得Stat5a与其靶位点脱离,上调了这些基因的表达。这些结果表明,Stat5a在小鼠妊娠后期通过与Erbb4、Tnfrsfl3c和Lgr6等与细胞有丝分裂、细胞凋亡和细胞分化等功能相关基因的靶位点结合,上调这些基因的表达,并进而通过这些基因所参与的信号通路,包括Shc/Grb2/Soc-Rac-Raf-MPK、NF-KAPPA和Wnt等发挥调控乳腺细胞增殖与分化的功能。上述结果表明,通过乳腺特异性表达PRL基因可以提高转基因动物的奶品质或奶产量,PRL胞内信号因子Stat5a可通过调节Erbb4、Tnfrsfl3c和Lgr6等靶基因的表达参与调控乳腺细胞的增殖与分化。