论文部分内容阅读
背景奥氮平属于第二代抗精神病药,它可以明显减少一代抗精神病药导致的锥体外系等副作用,但却引起体重增加、血糖升高等代谢紊乱。奥氮平引起代谢紊乱的机制目前尚未探究清楚,前人研究表明,脂肪细胞凋亡可以引起肥胖和胰岛素抵抗,而奥氮平引起的代谢紊乱与脂肪细胞凋亡的关系未见报道,本实验从奥氮平在临床用药浓度下引起脂肪细胞凋亡,进一步反馈性引起细胞增殖水平上升的角度探究奥氮平引起肥胖等代谢紊乱的分子机制。目的本课题通过建立奥氮平诱导的代谢紊乱大鼠模型探究奥氮平引起代谢紊乱的机制:通过模型动物组织以及细胞水平上进一步验证奥氮平引起细胞凋亡与细胞增殖的水平变化,从而探究奥氮平引起肥胖等代谢紊乱的具体机制。方法1.大鼠造模和分组:将30只210-230g SD(Spargue-Dawley)大鼠随机分为2组:对照组(Control组)和奥氮平组(Olanzapine组),每组15只。Olanzapine组每日灌胃奥氮平(1.5mg/kg),Control组给予等容量生理盐水。每周称体重,测空腹血糖,连续喂养8周。第2,4,6,8周末测胰岛素水平,经过8周喂养后,测定大鼠OGTT水平。8周末麻醉动物后取其白色脂肪组织和血浆。Western-blotting测定大鼠脂肪组织Klotho/Egr-1/MnSOD,P-Pi3k/P-Akt以及Cleaved/Caspase3的蛋白水平。RT-PCR测定大鼠脂肪组织Klotho和Caspase3的mRNA水平。2.细胞培养及实验:Western-blottingting测定奥氮平给药后3T3-L1细胞Klotho/Egr-1/MnSOD,P-Pi3k/P-Akt以及Cleaved/Caspase3的蛋白水平。不同浓度奥氮平给药后,测定细胞增殖及凋亡水平。3T3-L1细胞用5μM(临床给药浓度)给药后使用rKlotho干预,测定其细胞增殖水平及细胞凋亡水平变化。RT-PCR测定3T3-L1细胞Klotho和Caspase3的mRNA水平,免疫荧光技术观察奥氮平给药后Klotho水平变化。3.数据分析采用SPSS13.0统计软件数据统计分析。计量资料用?X±se表示,两组组间均数比较采用t检验,各指标组内比较采用重复测量方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.长期奥氮平给药可以引起大鼠脂类代谢紊乱对照组和奥氮平给药组大鼠体重均有增长,其中给药组增长更快,给药组大鼠造模第一周至第八周体重均明显高于对照组。奥氮平给药组第三周至第八周空腹血糖明显高于对照组水平,奥氮平给药组第二周,第四周,第六周,第八周胰岛素水平明显高于对照组水平。奥氮平给药组大鼠OGTT曲线下面积较对照组明显增多。以上结果表明奥氮平可引起明显体重增加、糖耐量受损等代谢紊乱,表明奥氮平大鼠代谢紊乱模型建立成功。2.长期奥氮平给药激活脂肪细胞凋亡和增殖相关通路奥氮平组大鼠白色脂肪组织中抗细胞老化因子Klotho蛋白与mRNA水平均明显降低,线粒体抗凋亡因子MnSOD水平明显降低,炎症激活相关蛋白—Egr-1水平明显升高,Cleaved-Caspase3/Caspase3凋亡蛋白水平明显升高。结果表明奥氮平给药后,大鼠白色脂肪组织的凋亡水平明显升高。同时,组织水平P-Pi3K/P-AKT的增殖因子蛋白水平均也明显升高,表明脂肪组织细胞增殖同时被启动。3.奥氮平可引起药物浓度依赖性的脂肪细胞凋亡在3T3-L1细胞中,不同浓度奥氮平给药(1μM,2μM,5μM,10μM,20μM)后观察细胞凋亡水平,Pearson相关分析显示,奥氮平浓度与细胞凋亡水平之间存在显著正相关(Pearson相关检验,r=0.775,P=0.000)。4.临床浓度奥氮平下脂肪细胞以异常增殖为主在3T3-L1细胞中,不同浓度给药(1μM,2μM,5μM,10μM,20μM)后,CCK-8试剂盒检测细胞增殖水平,结果显示在5μM的浓度时(临床用药浓度),细胞增殖水平占优势。5.加入rKlotho成功干预临床浓度奥氮平引起凋亡和脂肪细胞异常增殖在5μM浓度的奥氮平给药时与重组rKlotho蛋白共培养,细胞凋亡水平也明显恢复正常,同时CCK-8结果显示细胞增殖水平恢复正常。结论临床剂量奥氮平可通过激活Klotho/Egr-1/MnSOD通路引起细胞的凋亡,由于机体的保护机制,可能反馈性引起脂肪细胞增殖水平上升,机体的细胞凋亡与细胞增殖同时发生,导致了肥胖等代谢紊乱。加入rKlotho后,细胞凋亡水平明显下降,同时细胞异常增殖水平恢复正常。本研究第一次观察到奥氮平以剂量依赖性方式引起细胞的凋亡现象,使得我们从新的视角对奥氮平引起代谢综合征进行认识。该研究结果表明可以通过作用凋亡通路的靶点治疗奥氮平引起的肥胖相关代谢并发症,进一步改善奥氮平的治疗效果。