论文部分内容阅读
Reg3基因联合胰岛素自身抗原共同防治1型糖尿病的作用及分子机制。方法(1)提取纯化Reg3 cDNA目的基因片段,全长Reg3cDNA选择性插入PBudCE4.1真核表达载体Xho1、Kpn1酶切位点内,经阳性克隆筛选,获得重组载体PBudCE4.1/Reg3;重组载体及PBudCE4.1空载体脂质体法转染Cos-7真核细胞,β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒筛选阳性克隆,采用Western blot法检测细胞上清中Reg3蛋白的表达水平。(2)采用40mg/kg链脲佐菌素(STZ)连续5d腹腔注射建立1型糖尿病小鼠模型(T1DM),Reg3基因肌注BALB/c小鼠(100μg/只),同时联合胰岛素不完全弗氏佐剂(IFA)混合乳剂(100μg/只)皮下给药,每周1次,连续4周,分别设立单给药对照组。每周监测小鼠血糖值,6周后处死小鼠,取材。采用HE染色法进行小鼠胰腺组织病理学检查;ELISA法检测小鼠血清胰岛素的分泌水平;分离脾脏淋巴细胞并进行体外培养,流式细胞术(FACS)分析脾淋巴细胞CD4+CD25+ Foxp3+调节性T细胞阳性率;四唑盐比色法(MTT)检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应。(3)上述实验结束处死小鼠过程中,固定胰腺组织,采用原位末端标记(TUNEL)一步法检测胰岛β细胞凋亡;ELISA法测定血清细胞因子IL-2、IFN-γ、TGF-β及IL-10含量;Western blot法检测小鼠胰腺组织中Reg3蛋白表达水平,以及NF-κB,BcL-2,p-Akt1等信号蛋白的表达情况。结果(1)重组载体双酶切后经琼脂糖凝胶电泳证实目的基因Reg3存在,测序结果验证Reg3基因已插入PBudCE4.1真核表达载体,且未见点突变及读码框移;重组载体成功转染入Cos-7真核细胞,Western blot结果进一步显示,Cos-7细胞上清内出现大量的Reg3蛋白,实现Reg3基因在Cos-7细胞中的稳定表达。(2)少量多次腹腔注射STZ,可在BALB/c小鼠体内建立稳定的1型糖尿病小鼠模型(T1DM)。HE镜检发现,糖尿病模型小鼠大多出现胰岛结构不完整,胰岛细胞稀疏,淋巴细胞浸润显著,并伴随着血清胰岛素明显分泌不足等现象,Reg3基因联合胰岛素自身抗原治疗后,可有效减少胰岛细胞受损以及炎性细胞浸润,提高糖尿病小鼠胰岛素分泌水平,从而显著降低糖尿病小鼠血糖值(P<0.01),且停药2周后,降糖作用仍持续存在;FACS结果进一步显示,Reg3基因联合胰岛素治疗可明显促进糖尿病小鼠体内CD4+CD25+ Foxp3+调节性T细胞分化(模型组38.9%,Reg3/Ins组63.1%,P<0.05),同时降低脾淋巴细胞增殖能力(P<0.01)。(3)TUNEL法结果发现,Reg3基因联合胰岛素自身抗原治疗可有效减少胰岛β细胞的凋亡。ELISA结果显示,糖尿病模型小鼠体内Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ水平显著增加,TGF-β,IL-10等Th2型细胞因子含量明显下降,Reg3基因联合胰岛素自身抗原治疗可有效改善糖尿病小鼠血清细胞因子的异常分泌;Western blot结果进一步显示,糖尿病小鼠经Reg3治疗后可在胰腺组织高表达相关再生蛋白(P<0.05),有效上调p-Akt1蛋白活性,激活PI3K/Akt抗凋亡信号通路,促使NF-κB发生核转位,进而上调抗凋亡基因BcL-2的表达。结论Reg3基因联合胰岛素自身抗原对STZ诱导的T1DM小鼠有着明显的抗糖尿病作用,一方面通过诱导自身抗原免疫耐受调节性T细胞分化,抑制细胞免疫应答反应,减少炎症细胞以及淋巴细胞浸润;另一方面,通过相关再生蛋白的高表达,激活β细胞的抗凋亡通路,进而改善β细胞功能,恢复胰岛素正常分泌水平,两者发挥协同效应,从而有效防止T1DM的发病。