液体发酵条件对烟色烟管菌产活性多糖的影响

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近年来由于环境的破坏和野生资源的过度开采,自然界中药用真菌的子实体越来越少,液体发酵法逐渐成为制备药用真菌代谢产物的主要途径。目前药用真菌的发酵研究主要以真菌生物量或胞内、胞外产物的最大产量为目标进行液体发酵条件优化,而发酵条件变化对真菌代谢产物的种类、组成及活性等是否有影响却鲜有报道。本论文即在此背景下,以烟色烟管菌为研究对象,通过对不同发酵条件下所产多糖的理化性质、初级结构及生物活性进行检测,以探讨发酵条件的改变对真菌多糖产量、组成及活性的影响,旨在为获得特定组成、特定活性的烟色烟管菌多糖成分提供实验依据,同时也为药用真菌代谢调控的相关研究奠定理论和实验基础。本论文主要的研究内容及结果如下:(1)发酵条件对烟色烟管菌生长状态及多糖积累的影响不同发酵条件对比结果表明:碳源(葡萄糖、玉米粉、玉米秸秆、杨树锯末)、氮源(蛋白胨、硫酸铵、豆饼粉)、转速(120 rpm、150 rpm、180 rpm)、促进剂(Tween-80、油酸)对烟色烟管菌形态、生长状态、多糖积累均具有一定的影响。菌丝体生物量最高时的发酵条件分别为杨树锯末21.4 g/L,豆饼粉15.7 g/L,180rpm 16.6 g/L,油酸19.1 g/L。以胞内多糖产量为指标,碳源的影响为:玉米粉>玉米秸秆>杨树锯末>葡萄糖;氮源的影响为:蛋白胨>豆饼粉>硫酸铵;转速的影响为:150 rpm>180 rpm>120 rpm;促进剂的影响为:油酸>对照组>Tween-80。以胞外多糖产量为指标,则碳源的影响为:玉米秸秆>杨树锯末>玉米粉>葡萄糖;氮源的影响为:硫酸铵>豆饼粉>蛋白胨;转速的影响为:180 rpm>150 rpm>120rpm;促进剂的影响为:油酸>对照组>Tween-80。上述结果说明发酵条件的改变对烟色烟管菌菌丝体生物量及胞内、外多糖产量均具有一定的影响。(2)发酵条件对烟色烟管菌多糖理化性质、初级结构的影响对不同发酵条件下制备的胞内、外去蛋白多糖进行了理化性质和初级结构的检测。采用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、福林-酚法和间羟基联苯法分别测定多糖的总糖、蛋白质、多酚和糖醛酸含量,结果表明,不同发酵条件下产生的胞内、外多糖的化学组成发生改变。其中,添加油酸培养的胞内多糖具有最高的糖含量46.10%,以杨树锯末为培养时的后续碳源,制备的胞内多糖具有最高的糖醛酸含量10.64%;以硫酸铵为培养时的氮源,制备的胞外多糖具有最高的糖含量78.87%,以玉米秸秆为培养时的后续碳源,制备的胞外多糖具有最高的糖醛酸含量11.49%。不同发酵条件制备的多糖在总糖和糖醛酸含量上差别较大,蛋白质与多酚含量的差别相对较小。通过HPGPC、HPLC检测多糖的分子量及单糖组成,结果显示不同发酵条件下制备的多糖分子量及单糖组成不一致。胞内多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖组成,但单糖的种类及含量不同,如以玉米秸秆及杨树锯末作为培养时的后续碳源,制备的胞内多糖IPScs、IPSps的木糖含量分别达6.7%、6.6%,明显高于其它胞内多糖。大多数胞外多糖主要由葡萄糖组成,且葡萄糖含量均超60%,而以葡萄糖作为培养时的碳源,制备的胞外多糖EPSg主要由甘露糖组成,其甘露糖含量高达77.2%。上述结果说明,发酵条件的改变对烟色烟管菌多糖的组成以及结构均造成了一定的影响。(3)发酵条件对烟色烟管菌多糖的抗氧化活性和体外抗肿瘤活性的影响不同发酵条件制得的烟色烟管菌胞内、胞外多糖具有一定的DPPH自由基清除活性、羟基自由基清除活性、亚铁离子螯合活性及还原力,同时存在剂量效应,但不同多糖间的活性具有一定的差异性。采用Hela细胞模型研究分析了烟色烟管菌多糖的体外抗肿瘤活性。结果表明,大多数胞内、外多糖对Hela细胞的增殖有抑制作用,且胞内多糖的抑制效果高于胞外多糖,其中当多糖浓度为2.5μg/μL时,添加玉米秸秆作为培养时的后续碳源,制备的胞内多糖IPScs对Hela细胞增殖的抑制率高达66.9%;120 rpm条件下制备的胞内多糖IPS120的抑制率为61.3%。此外,添加油酸培养的胞内多糖IPSoa对细胞的增殖呈现促进作用。上述结果说明,发酵条件的改变对烟色烟管菌多糖体外抗肿瘤活性的发挥具有一定的影响。
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