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刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种呈世界分布的机会性致病原虫,几乎可以感染所有温血动物,会引起严重的人兽共患寄生虫病,世界上有三分之一的人口存在感染风险。犬是人类接触密切的伴侣宠物,也是弓形虫的重要中间宿主,能通过多种途径将弓形虫传染给人类。目前针对弓形虫病的防治尚无商品化弓形虫疫苗,因此研制行之有效的犬弓形虫疫苗对于预防弓形虫病,降低人类感染弓形虫风险具有重要意义。当前弓形虫基因工程疫苗研究主要包括亚单位疫苗、基因缺失疫苗、重组活载体疫苗和DNA疫苗等,其中亚单位疫苗具有构建简单,安全性高等优点而备受关注。本试验将弓形虫ENO2、GRA7基因与小鼠IL-2基因串联,表达ENO2-GRA7-IL2重组蛋白,免疫Balb/c小鼠对其免疫保护效果进行评价。在此基础上为了评价重组蛋白对犬的免疫效果,将犬IL-2与弓形虫ENO2、GRA7基因进行串联构建ENO2-GRA7-IL2（D）重组质粒,将其诱导表达后免疫比格犬,综合评价其免疫保护效果。ENO2-GRA7-IL2重组蛋白的表达与鉴定通过PCR扩增RH株弓形虫ENO2、GRA7基因和小鼠IL-2基因,分别构建p ET-32a-ENO2、p ET-32a-GRA7和p ET-32a-IL2重组质粒。将三种基因进行生物信息学分析后,通过柔性Linker序列连接合成p ET-32a-ENO2-GRA7-IL2重组质粒,经大肠杆菌表达系统诱导表达后,His标签镍柱纯化,SDS-PAGE分析,Western blot鉴定其反应原性。结果显示,重组质粒经双酶切分别得到ENO2-GRA7-IL2（2376bp）、ENO2（1335bp）、GRA7（447bp）和IL-2（510bp）四个目的条带。经诱导表达分别得到重组蛋白ENO2-GRA7-IL2（110k Da）、r ENO2（70 k Da）、r GRA7（45 k Da）和r IL2（40k Da）,大小与预期相符。Western blot表明ENO2-GRA7-IL2重组蛋白具有较好的反应原性。ENO2-GRA7-IL2重组蛋白对小鼠的免疫保护性研究将105只Balb/c小鼠随机分为阴性、阳性对照组、r ENO2组、r GRA7组、r IL-2组、混合免疫组和ENO2-GRA7-IL2免疫组,每组15只,皮下注射免疫两次。二免两周后检测小鼠外周血淋巴细胞比例和细胞因子水平。将弓形虫速殖子按1×10~3/只剂量感染小鼠,观察存活时间。感染后6天剖检小鼠,检测肝脏荷虫量并制作组织切片观察其病理变化。结果显示,与对照组相比,除混合免疫组外其余免疫组CD4+/CD8+比例显著上升（p＜0.05）,所有免疫组小鼠血清IFN-γ均显著上升（p＜0.05）,r ENO2组、r GRA7组ENO2-GRA7-IL2组IL-12显著上升（p＜0.05）。免疫保护试验结果表明,ENO2-GRA7-IL2组小鼠经21天试验周期仍存活4/8,其余感染组小鼠全部死亡。肝脏荷虫量试验结果表明各免疫组肝脏荷虫量相比阳性对照组均显著下降（p＜0.05）,ENO2-GRA7-IL2免疫组荷虫量下降92.71%。ENO2-GRA7-IL2免疫组肝细胞未见明显变性,且仅有少量中性粒细胞浸润,其余免疫组均出现肝细胞变性坏死和大量中性粒细胞浸润等病理变化。ENO2-GRA7-IL2（D）重组蛋白对犬的免疫保护性研究将犬IL-2基因与ENO2和GRA7通过Linker串联后构建p ET-32a-ENO2-GRA7-IL2（D）重组质粒,利用大肠杆菌表达系统诱导表达后SDS-PAGE和Western blot鉴定其反应原性。将8只比格犬随机分为阴性对照组2只、阳性对照组3只和免疫组3只,重组蛋白皮下分点注射,进行两次免疫。分别于一免前至二免后两周每隔7 d收集血清用间接ELISA方法检测其抗体水平。二免后两周后感染RH株弓形虫速殖子,记录体温变化和临床表现。攻虫后8 d将犬安乐死剖检取肝脏,利用绝对荧光定量PCR检测荷虫量并制作病理组织切片。结果显示成功获得大小为100 k Da重组蛋白ENO2-GRA7-IL2（D）,Western blot鉴定具有较好的反应原性。免疫后犬的抗体水平上升,最高达1:25600。攻虫后阳性对照组与免疫组犬体温均上升,阳性对照组出现明显临床症状并有轻微腹水。免疫组平均肝脏荷虫量与阳性对照组相比平均降低61.08%,差异极显著（p＜0.01）。免疫组肝细胞未出现明显病理变化且中性粒细胞浸润少。以上结果表明重组蛋白ENO2-GRA7-IL2（D）对犬弓形虫急性感染起到了一定的免疫保护作用。综上所述,本研究表达了ENO2-GRA7-IL2重组蛋白,证明了其对小鼠免疫保护效果优于单一重组蛋白。制备ENO2-GRA7-IL2（D）经免疫保护性研究,初步证明重组蛋白对犬弓形虫急性感染具有一定的免疫保护效果,为今后深入研究犬弓形虫病的免疫预防提供了参考。