CRISPR-Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and their associated genes）是原核生物用来抵御病毒和噬菌体等外来遗传物质的一种获得性免疫系统,该系统大概分布于40%细菌和90%古菌中。目前,CRISPR-Cas系统分为两大类（Class1、Class2）,六个型（Type Ⅰ-Ⅵ）。其中属于Class2的Cas9和Cas12系统已经广泛地用于各种不同的真核生物以及原核生物的基因编辑,引领了一场伟大的生物学革命。基于此,这一革命性的技术的发现者也在2020年获得了诺贝尔化学奖。然而,Cas9和Cas12系统在原核生物中的分布并不广泛,大量存在于古菌和细菌中的则是属于Class1的I型和Ⅲ型CRISPR免疫系统。冰岛硫化叶菌（Sulfolobus islandicus）REY15A是古菌研究中的重要模式生物,它编码了三种CRISPR系统,分别是属于Type I的Ⅰ-A和属于Type Ⅲ-B的Cmr-ɑ和Cmr-β。在过去的10年里,本实验室采用遗传学、生物化学和结构生物学方法对两种Ⅲ-B型CRISPR免疫系统,即Cmr-ɑ和Cmr-β,进行了系统地研究。但是,对于Ⅰ-A免疫系统,即在该古菌基因编辑中展示出最强免疫活性的CRISPR系统,还停留在对其免疫活性的初步遗传表征上,其主要原因是,Ⅰ-A型CRISPR复合物的纯化问题难以得到突破。因此,本研究的主要目的是通过不同途径,探索纯化完整Ⅰ-A复合物的方法,得到完整的复合物,进而揭示Ⅰ-A型CRISPR免疫系统的分子机制,为该免疫系统的进一步开发与利用、以及研究微生物与它们的病毒的相互作用及其分子生态学提供坚实的基础。本研究首先构建了8个不同的复合物共纯化的表达质粒,并将这些质粒转化到S.islandicus REY15A中进行纯化测试,通过对这些不同的纯化结果的分析,找到了纯化S.islandicus REY15A中Ⅰ-A复合物的最佳方法,即给Ⅰ-A组分中的Cas5或者Csa5蛋白加标签时具有非常好的共纯化效果。另外为了后续的蛋白纯化和生化实验,本实验利用内源性CRISPR系统对Ⅰ-A型CRISPR系统基因簇进行了以下的操作:（1）更换S.islandicus REY15A中Ⅰ-A型CRISPR系统基因簇的启动子,从而增加了Ⅰ-A复合物基因簇的转录量。（2）将基因组上csa5基因的5’端加入10×His的标签,用于后续的蛋白纯化。（3）敲除基因组上原有的CRISPR arrays,以便于后续的生化实验。通过启动子更换与基因组上原位加标签的纯化方式,有效的提高了蛋白纯化效率,增加了蛋白获得量。但是,后续通过对获得蛋白进行检测时发现该蛋白中只含有Cas7、Cas5、Cas8和Csa5亚基组成的复合物骨架,不含有Cas3’和Cas3"亚基。该结果,与Type I-D,Type I-E和Type I-F的复合物中的纯化情况相似。但与Plagens在体外组装Type Ⅰ-A复合物时的实验结论相悖,即Cas3’和Cas3"是复合物组成的必要部分,对复合物的稳定具有重要的作用。然而我们的纯化实验表明Cas3’亚基并没有与复合物紧密结合,更像是后期被复合物骨架招募而来。为了验证纯化到的Ⅰ-A复合物骨架是否具有体外活性,本实验分别将Cas3’和Cas3"蛋白从古菌中纯化,并初步尝试与现有的复合物骨架共同孵育,验证复合物是否具有体外的生化活性。本研究在之前的基础上第一次从宿主体内纯化到了较为完整的复合物骨架。虽然在与Cas3’和Cas3"蛋白的体外共孵育中并未出现预期之中的活性,但是为今后的实验打下来良好的基础。并且在复合物纯化过程中也出现了诸多与之前已发表论文不同的现象,值得后续的详细研究。