第一部分中国幼年及成年强直性脊柱炎患者HLA-B27多态性分布特点研究　　 背景：强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一种具有高度遗传性的常见风湿性疾病，主要侵犯脊柱和骶髂关节，致残率高，人群发病率约0.3％。AS与HLA-B27强相关。已证实因遗传因素和地理位置的差异，B27亚群在各种族人群中分布不同。在中国大陆，有关B27等位基因在AS患者中的分布还没有大型的研究。　　 目的：研究中国汉族幼年及成年强直性脊柱炎患者HLA-B27亚型分布情况，并分析此两种临床类型患者的B27亚型分布是否存在差异。　　 方法：AS患者共505例，来自2005年1月-2008年12月本院风湿科门诊及病房，为中国汉族人群，16岁以下起病者为幼年强直性脊柱炎(JAS)，共145例，16岁以上起病者为成年强直性脊柱炎(AAS)，共360例。患者满足1984年修订的强直性脊柱炎纽约诊断标准。与JAS组及AAS的年龄、性别相匹配的健康志愿者对照组共1368例，其中匹配JAS对照组156例，匹配AAS对照组1212例。盐析法提取基因组DNA。用Luminex液态芯片，结合PCR-SSOP技术对HLA-B位点做低分辨分型(AccuPlexTM，Dynal-Invitrogen，美国)。部分标本用血清学方法(微量淋巴细胞毒法)检测HLA-B27抗原。HLA-B27阳性者进一步用PCR-SSP方法做高分辨B27亚型检测(Dynal-Invitrogen，美国)。PCR-SSP法分型为HLA-B*2715的样本再行直接测序分型，验证结果。采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。　　 结果：　　 1.AS患者505例中，B27阳性453例，总阳性率89.7％，而1368例健康对照中B27阳性74例，总阳性率5.41％，二者差异有显著性(P<0.001)。　　 2.HLA-B*2704在AS组显著高于对照组(P<0.001)；而B*2705显著低于对照组(P<0.001)；B*2715和B*2702在B27阳性患者组中分别占1.32％和0.66％，而对照组均为0，但与对照组问无显著差异(P均>0.05)。　　 3.JAS组出现3种亚型(B*2704、B*2705和B*2715)，AAS组出现4种亚型(B*2704，B*2705，B*2715和B*2702)，两组B27亚群分布无统计学差异(P均>0.05)。　　 4.携带B*2715等位基因的有三例JAS和3例AAS患者，其中JAS的起病年龄分别为5、9、13岁。　　 5.共5个B27亚型出现于健康对照人群(B*2704，05，03，06和07)，与JAS和AAS匹配的两个健康志愿者对照组各亚群间无统计学差异(P均>0.05)。　　 结论：　　 1.HLA-B*2704是中国JAS和AAS患者的主要亚型，与AS相关。　　 2.HLA-B27亚型分布在JAS和AAS患者两组间无显著性差异。　　 3.HLA-B*2715作为HLA-B27罕见亚型，只发现于AS患者，是潜在的参与AS致病相关的HLA-B27亚型。　　 第二部分幼年AS患者HLA-B27各亚型临床表现及B27等位基因致病机制初步研究　　 --不同HLA-B27亚型患者MMP-3、sRANKL和OPG变化及意义　　 背景：症状出现于16岁以前的强直性脊柱炎定义为幼年强直性脊柱炎(JAS)，占AS的10％-20％。JAS临床表现与成人AS不同，而B27亚型与临床表现的关系在成人已有较多报道，在JAS中有待更多研究。研究显示JAS功能预后可能更差，而近年AS患者骨丢失、骨质疏松的状况受到重视，研究JAS中是否有骨代谢的异常及骨代谢相关因子与炎症因子的关系，对临床诊治、改善预后有积极意义。　　 目的：1.在第一部分B27基因分型的基础上，探讨JAS和AAS患者B27不同亚型间临床表现的差异及JAS组内各亚型临床表现的差异；2.检测JAS组患者血清基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、可溶性核因子NF-kB受体活化因子配体(sRANKL)和骨保护素(OPG)水平，探讨各指标与JAS临床特征的相关性及不同亚型患者问血清水平有否差异。　　 方法：JAS组患者145例，其中检测MMP-3、sRANKL和OPG的患者分别为56例、62例和68例。AAS组患者360例。血清学检查健康志愿者对照组32例。同时收集患者病史、体检、强直性脊柱炎疾病活动指数(BASDAI)、功能指数(BASFI)及实验室检查资料。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测JAS患者和健康志愿者血清MMP-3、sRANKL和OPG水平，并与临床指标进行相关分析。　　 结论：　　 1.JAS临床特征与AAS有差异，JAS男性比例、肌腱端炎及髋受累更多见，尤其髋受累者预后较差，临床应积极治疗，减少残疾。　　 2.JAS组B*2704、05和15亚型问临床特征、MMP-3、sRANKL及OPG的变化无明显差异。　　 3.JAS患者中sRANKL表达显著增高，提示患者有破骨代谢增强，在JAS患者的诊治中应关注骨代谢异常的情况。　　 第三部分 AS患者HLA-B*2715等位基因致病相关机制的初步探讨　　 第一章一个HLA-B*2715的AS家系患者临床特点、全基因组SNPs连锁分析和血清MMP-3、sRANKL和OPG变化及意义探讨　　 背景：强直性脊柱炎(AS)是一种主要侵犯中轴关节及外周大关节的慢性进行性炎症性疾病。通过分子遗传学技术，对AS的家系、孪生子和病例-对照进行研究，证实AS足以B27为主要易感基因的多基因遗传病。单核苷酸多肽性(single nucleotide polymorphism，SNP)是继限制性片段长度多态性和微卫星多态性这两种遗传标记后的第三代遗传标记，在复杂疾病的遗传学研究中成为新的研究工具。HLA-B*2715是出现于亚洲的罕见B27亚型，对一携带此基因的AS家系，进行临床、免疫学及SNPs研究，有助于探讨此等位基因与AS的相关性及其致病机制。　　 目的：通过收集家系临床资料、对成员的B*2715基因进行SNPs扫描分析及检测炎症及骨代谢指标，探讨此亚型的特征，以助揭示AS的发病机制。。　　 方法：收集14位家系成员临床资料；用含620901个SNPs的高密度基因芯片HumanHap610-quad chip在Illumina Infinium arrays上对患者B*2715基因进行SNPs分型；用ELISA方法检测13例成员血清MMP-3、sRANKL和OPG水平。　　 结论：　　 1.本家系携带B*2715的成员AS发病率高，提示B*2715是与AS相关的亚型。　　 2.虽然B*2715基因SNP的LOD值小于1,因本家系样本只有7例，不能排除B*2715是AS的易感基因，需继续积累病例验证。　　 第二章 HLA-B*2715基因真核细胞慢病毒表达载体的构建和转染　　 背景：强直性脊柱炎(AS)是一种具高度遗传性的疾病。1973年发现HLA-B27与AS的强相关以来，许多证据表明B27直接参与了发病，认为B27分子是AS的原发关联成分。HLA-B27具有多个亚型，B2705分布最广，是祖先亚型，研究认为其他亚型是由B*2705基因发生突变、移位或其他机制形成。因此，大多数对B27亚型的基础研究都是围绕B*2705进行。目前被认为与AS致病密切相关的亚型主要有B*2702、B*2704、B*2705等。见于亚洲的B*2706可能是一种保护性基因，而亚洲的另一基因B*2715，因出现频率低和发现时间短，研究结果较少，与AS之间的关系尚不清楚，本课题前期研究显示携带此基因的散发患者发病时间早，而家系成员AS发病率高，提示可能是与AS相关的亚型，故将此基因的克隆载体转入单核细胞系，体外研究其功能，将有助于探讨B*2715与AS的相关性及致病机制。　　 目的：构建HLA-B*2715慢病毒载体，转染U937细胞系，建立稳定表达B*2715基因的细胞，以研究该基因的功能。　　 方法：全基因合成法合成HLA-B*2715 cDNA序列，构建pUC57-B*2715质粒载体(用于保存cDNA)，酶切及测序鉴定；构建PL-B*2715-GFP目的穿梭质粒载体，酶切鉴定；在293T细胞中进行慢病毒包装(四质粒系统，其中目的穿梭质粒含有能表达绿色荧光蛋白的GFP基因)；慢病毒转染U937细胞(单核细胞系)及对照细胞293T细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。　　 结果：pUC57-B*2715载体及PL-B*2715-GFP目的穿梭质粒载体酶切鉴定，电泳条带片段大小与目的基因一致。慢病毒感染U937及293T细胞，传代后仍能表达绿色荧光。U937细胞转染率约10％-15％，293T细胞转染率约60％-70％。　　 结论：初步构建了人HLA- B*2715基因和GFP(绿色荧光蛋白)基因共表达慢病毒载体，将为进一步研究HLA-B2715在AS致病机制中的作用提供新的技术平台。