目的:本论文立足于前期研究基础,拟从理论及实验两方面展开。理论部分将梳理中西医学对光影响昼夜节律的认识,生理基础和调节机制,以及眼睛在昼夜节律产生和维持中的重要作用,为后面实验研究提供铺垫。实验部分以光介导的昼夜节律研究为切入点,观察光与斑马鱼生长的相关性,确立斑马鱼的光照睡眠剥夺模型,选取恢复昼夜节律经典代表方安寐丹（Anmeidan,AMD）,分析其对斑马鱼不同时间点MAPK/MNK/eIF4E通路有关基因和蛋白的影响,从而探讨该方干预治疗失眠,恢复昼夜节律紊乱的作用机理,以期为中医睡眠和昼夜节律研究的发展,临床失眠症的防治提供参考。方法:理论探讨:采用经典梳理、文献检索、理论研究的方法,系统搜集整理有关昼夜节律方面的文献进行分析归纳,凝练其理论内涵、生理基础、表现形式和临床运用,并以光为切入点,从眼睛的角度分析外环境中光对昼夜节律形成的影响,挖掘这一理论的思考及其现代指导意义,在此基础上,选择清代名方安寐丹,检索分析其适用证候、组方配伍、临床运用,为实验研究的开展提供理论指导。实验研究:选用1-9dpf的野生型AB系斑马鱼,实验一为光对斑马鱼昼夜节律的影响及睡眠剥夺模型的确立:观察1-5dpf不同光暗环境下的形态学差异及MAPK/MNK/eIF4E通路mRNA水平,行为学分析持续光刺激下3-9dpf斑马鱼的昼夜节律,确立斑马鱼睡眠剥夺模型;实验二为AMD对斑马鱼睡眠剥夺模型行为学的影响:行为学分析光介导的5dpf斑马鱼SD模型行为学的影响,以及安寐丹及其拆方和组成单药对斑马鱼睡眠剥夺模型的行为学干预作用。实验三为AMD对斑马鱼SD模型MAPK/MNK/eIF4E通路的影响:利用PT-PCR、ISH、IF方法研究AMD对斑马鱼SD模型MAPK/MNK/eIF4E通路mRNA水平的影响,并观察脑内通路相关基因和蛋白的表达情况。结果:理论探讨:昼夜节律是受位于下丘脑前区视交叉上核调节的生物、生理和行为的周期,是有机体适应自然的一种表现。光作为重要的授时因子,可以激发节律振荡器,调节全身系统节律变化。这种作用的机制,西方医学从微观角度的生物钟接收、输入通路研究,中医学则从天人相应的宏观角度进行分析,中西医学虽然理解的出发点不同,但都离不开眼睛这个接收光信号的重要器官,中医学目睛命门别白黑,传脑心,再由以足太阳为首的诸经、诸脉行于全身,与现代医学视网膜接收外界信号输入至视交叉上核,通过输出通路输出节律信号产生近日节律的理论,二者不谋而合。这一观点可以为进一步开展光与节律相关性研究,指导临床昼夜节律紊乱性疾病的预防和治疗,提供启发和思路。实验研究:实验一:（1）正常14:10h LD光暗循环斑马鱼的发育明显快于24h全黑暗环境的DD组,而DD组斑马鱼从细胞周期发生开始就明显晚于LD,随后原始器官发生、体轴伸直状态、色素沉着、胚胎孵化、运动行为、卵黄消耗与觅食等情况也是明显缓慢。说明光照对斑马鱼的生长发育有影响。（2）随时间增长MAPK3、MKNK1、MKNK2a、PER1a、PER2都逐渐升高,MAPK1、eIF4Ea、eIF4E1b则有逐渐降低的趋势。与DD组相比而言,LD组MAPK/MNK/eIF4E通路各基因mRNA水平普遍升高,而DD多从第三天开始mRNA水平逐渐增长。证明了光环境的促发育作用,并说明光照对斑马鱼MAPK/MNK/eIF4E通路的相关基因产生影响。（3）3-9dpf斑马鱼200lux持续完整光照刺激下,定时器时间（zeitgeber time,ZT）约30h开始出现昼夜节律紊乱,静止状态减少,节律周期尚可,表现为小运动距离增加、时长减少的片段化运动,这种情况持续约20h,然后静止状态增加,小运动减少,大运动增加,逐渐适应环境,到ZT100左右节律恢复,但时间相位后移,至下一个静止状态出现（ZT150）,节律周期时间明显延长。实验二:（1）根据斑马鱼追踪轨迹图,斑马鱼幼鱼活动轨迹以中运动为主。较空白组而言,其他各组运动路程增加,覆盖范围扩大。药物处理后,与模型组比较,活性增强,大运动增加明显。量化结果统计发现,与空白组相较,模型组ZT12-24时间段的休息总时间、连续的长时间休息、休息回合次数减少;ZT6-18时间段总的活动量以及觉醒时的活动量都有所增加。给药后,中药组可减少觉醒时的活动量,ADMm和ADMh主要增加ZT12-24时间段的休眠,ADMl却表现为逐渐减少的特点。（2）AMD拆方低剂量组中,生酸枣仁有兴奋作用,麦冬有白天兴奋夜间镇静的特征,其余各组为镇静作用。中剂量组中,各组ZT0-12期间静止状态增加,小运动和大运动状态减少,而ZT12-24期间则相反,静止减少,运动增加,以去茯神组最明显。高剂量组中,各组表现为静止减少、运动增强为主现象,并且以小运动增加为主,在ZT12-24区间更为明显。（3）单药实验中,人参组中、高剂量,当归组高剂量,丹参组高剂量,石菖蒲组高剂量,五味子组中、高剂量,以及甘草组高剂量组出现不耐受现象。较SD模型而言,茯神、人参中剂量、麦冬高剂量、当归高剂量ZT0-18静止状态总距离和时长增加,运动距离和时长降低;甘草低剂量组也有上述现象,但出现在ZT12-24时间段;其他组多静止状态距离与时长降低,运动状态距离与时长增加为主。实验三:（1）正常斑马鱼MAPK/MNK/eIF4E通路的相关基因呈节律性改变,SD模型的MAPK基因、PER基因和eIF4E1b总体表达下调,但未见统计学差异。与模型组比较,中药各组能上调MAPK/MNK/eIF4E通路相关基因表达,以10点和16点较为显著,尤其是MAPK3、MAPK1、MKNK2a、eIF4E1b、PER2这几个基因水平上升更为明显,与对照组上调的基因和时段相当。（2）ISH实验显示通路相关基因在脑中的表达也有明显的昼夜节律性特点,主要覆盖眼部、端脑、间脑和中脑。各基因表达多于上午升高,然后逐渐减少,光照后表达略有上调,各时间段差异缩小。药物干预后能降低上调水平,恢复紊乱表达现象。（3）IF提示MAPK3、eIF4E、PER2的表达主要包含眼部、端脑、间脑等部位。较对照组而言,模型组MAPK3、p-ERK1以及eIF4E的表达降低,PER2的表达上调。与模型组比较,MT对MAPK3和eIF4E有下调效果,同时增加PER2的表达含量。AMD的低剂量组和高剂量组可以上调四个通路相关蛋白的表达,但统计荧光强度未见显著差异。结论:1.光照是昼夜节律最主要的授时因子,以《黄帝内经》为代表的中医学中记载着大量昼夜节律与生命健康相关的内容,以天人相应前提,以元气-阴阳-五脏神为物质基础,以目睛命门为开阖枢纽,观自然界日月更替、昼夜变换,感天地之召应,依靠元气-阴阳-五脏神的协调互用,保障人体节律正常运转,以适应自然、社会发展规律的不断变化。然而随着现代光照条件的改变,科技的发展使人们生活环境中的光照时间不再只依赖于太阳升落,夜间人造光源的普遍存在所造成的光污染,引发昼夜节律紊乱、睡眠障碍等一系列疾病。因此,深入认识昼夜节律对人体的生理病理意义,探讨光照等外源因素对机体各方面昼夜节律的影响及其机制仍然是未来时间医学以及时间生物学的重要课题。2.光作为重要的授时因子是昼夜节律的产生基础之一,光照也是失眠的重要影响因素。如实验一所示,正常14:10h LD光暗循环斑马鱼的发育明显快于24h全黑暗环境的DD组（图1）,光介导的MAPK/MNK/eIF4E通路mRNA水平也会发生相应改变（图2）,在持续性的光照干扰下昼夜节律由紊乱到恢复适应,但时间相位后移,节律周期延长现象。实验二、实验三发现,模型组在白天段休息增加,夜间段休息减少,其活动节律较正常斑马鱼波动幅度降低,AMD能恢复昼夜节律变化趋近于空白组,其中低剂量组兴奋作用相对明显,高剂量组镇静作用较为明显,中剂量组介于二者之间,使白天活动性增加,夜间休息时间延长,重在恢复节律（图6-8）。MAPK/MNK/eIF4E通路相关基因在头部的表达主要覆盖眼部、端脑、间脑和中脑,荧光素酶在视网膜、松果体、丘脑、视前区、视后区等以及中脑大部分区域高表达,持续光照刺激对其抑制作用更为明显。给予药物干预后可以上调该通路的基因和蛋白水平,其结果与行为学较一致（图9-11）。提示光照对斑马鱼昼夜节律产生影响,并与光照强度、时长、周期相关,中药AMD可恢复光介导的斑马鱼SD模型昼夜节律,改善睡眠效果与剂量呈正比,其机制可能与调节MAPK/MNK/eIF4E通路相关。3.实验选取模式生物斑马鱼9dpf内的幼鱼为研究对象,通过浸泡给药的方式观察药物对其影响。幼鱼于第3天开始脏腑逐渐发育成熟,5dpf开始觅食,至9dpf内都可以从自身的卵黄囊中获取营养物质,因此可以推断药物在幼鱼中的渗透途径应为皮肤、粘膜、腮及以口、食道、胃肠为主的消化系统,符合中药的给药方法及通过脏腑为中心的作用理论。以光照刺激作为疾病模型也较为符合临床失眠症的发病因素。由此提出假说,中药的作用是否通过改变人体的体内外环境、调整机体内环境稳态来发挥治疗疾病的目的。实验中药物MTC的初筛方法,即是取药物占人体体重与体液比例区间,体液约占人体体重的1/10,可以看作体重比例是机体浸泡于药液中,类似中药浸泡外用给药法;体液比例是脏腑浸泡于药液中,类似中药口服内用给药法。实验发现组方的MTC并不适用于方中所有单味药物,人参、当归、丹参、石菖蒲、五味子、甘草等药物浓度达到AMD MTC(4.00mg·mL^-1)时斑马鱼出现死亡,甚至有些药物1/3 MTC也有部分鱼死亡现象（表2）,而前期实验中发现炒酸枣仁MTC达到35 mg·mL^-1。对AMD逐一拆方,发现去除生酸枣仁后,低剂量组镇静效果增加,提高剂量镇静效果反而减少,恢复昼夜节律作用明显。以上结果提示了药物配伍的协同增效作用,也给我们启示,药物发挥作用的方式是否可能通过调节PH值等改变斑马鱼的体外环境和体液环境,达到纠正紊乱,恢复阴阳平衡的效果。同时当药量不适或配伍不当,也会对体内产生影响,甚至出现药物的毒性反应。如果说光照是通过改变外环境对机体产生影响,那么中药是否就是通过改变内环境对机体产生效应。这一问题还值得进一步探讨研究。