灰树花中具有生物活性多糖的提取、纯化、结构分析与应用

来源 :中国矿业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zuozqzq7013
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天然产物中具有生物活性组分的主要物质为多糖,多糖具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤及免疫调节等生物活性被广泛关注。灰树花作为我国新型的中药材,具有消炎、降血脂、肝保护及增强机体免疫功能被广泛关注,目前对于灰树花多糖提取方法、工艺优化及多糖的生物活性机理的研究少有报道。本论文从灰树花的提取方法与提取工艺的优化,粗多糖的分离纯化,纯多糖的理化性质、结构表征、抗氧化、抗菌、抗肿瘤、肺保护及免疫调节等方面,研究了灰树花多糖的各种性质。开发了分级萃取及超临界CO2技术萃取从灰树花中提取多糖的方法,通过响应面法优化对分级萃取及超临界CO2萃取的工艺并找到最佳的提取工艺条件。超声辅助分级萃取灰树花多糖的最佳工艺参数在提取温度35.6℃,液料比33.8m L/g,提取时间47 min,超声功率104.6 W时多糖收率为6.91±0.11%(n=5)。超临界CO2技术从灰树花中提取多糖的工艺参数为提取温度为36.7℃,提取压力34.5 MPa,提取时间116.3 min,夹带剂用量为286 m L条件下灰树花多糖得率为4.63±0.13%(n=5)。与传统的灰树花多糖的提取方法相比,分级萃取及超临界CO2萃取,不仅得率较高,而且对多糖友好不会破坏其自身结构。超临界CO2提取的多糖通过DE-52及葡萄糖琼脂G-300色谱纯化灰树花多糖,得到了一个主要的纯化组分,命名为GFP;超声分级萃取灰树花多糖通过DE-52及葡萄糖琼脂G-300色谱纯化灰树花多糖,得到了两个主要的纯化组分,分别命名为GFP-1-a及GFP-2-a。对以上三种多糖进行理化性质与结构分析,通分析表明GFP、GFP-1-a及GFP-2-a均是含有硫酸基的酸性多糖;通过高效凝胶渗透色谱(HPGPC)测得GFP、GFP-1-a及GFP-2-a它们的相对分子质量为1.80×10~6Da、1.22×10~6Da以及1.71×10~6Da;GC-MS法测得GFP、GFP-1-a及GFP-2-a它们均有不同比例的葡萄糖,木糖,半乳糖,鼠李糖,岩藻糖,阿拉伯糖,甘露糖等单糖组成;通过刚果红试验、透射电子显微镜分析表明三种多糖均具有三股螺旋构象。结果说明三种多糖都都具有潜在的生物活性。多糖通过对DPPH的清除能力、ABTS的清除能力、超氧阴离子的清除能力及与铁离子螯合的能力,综合评价了灰树花多糖的体外抗氧化能力;通过构建小鼠的急性酒精肝损伤模型评价了灰树花多糖的体内抗氧化能力及护肝作用。结果表明,灰树花多糖具有较好的体外抗氧化活性;还能有效降低小鼠因酒精造成的肝损伤中血清中ALT及AST值,能有效提高小鼠肝脏中活性组分CAT、GSH-Px及SOD的值,同时可使MDA的含量减少,能对TNF-α及L-1β的表达起到抑制作用。灰树花多糖可能是通过抑制IL-1β及TNF-α等促炎因子表达、提高体内抗氧化酶的活性、螯合金属离子和清除体内自由基等方式发挥体内抗氧化的作用及肝保护作用。通过多糖抑制大肠杆菌、金黄葡萄球菌及铜绿假单胞菌的的抑菌效果及抑菌能力,综合评价了灰树花多糖的体外抗菌能力;通过构建金黄葡萄球菌及铜绿假单胞菌感染的小鼠模型评价了灰树花多糖的体内抗菌能力。结果表明,灰树花多糖具有较好的体外抗菌能力。灰树花多糖能有效降低因金黄葡萄球菌及铜绿假单胞菌感染小鼠的死亡率、小鼠的肝脏系数、肾脏系数、小鼠的白细胞数(White Blood Cell,WBC)及中性粒细胞的百分比(Neutrophils Rate,NEUT%),同时也能恢复因感染受损的机体细胞。灰树花多糖能够较好的发挥体内抗菌的作用。构建PM2.5导致小鼠肺损伤模型,分析了灰树花多糖对小鼠肺组织的保护作用。灰树花多糖能有效减轻小鼠因PM2.5致肺损伤中肺水肿的程度,缓解小鼠因肺损伤产生的炎性反应,增多中性粒细胞数量,降低小鼠因PM2.5对机体组织的毒效应,对肺泡中的血管膜起到保护作用,减少支气管中BALF里TP、CRP、ALB、LDH、MPO、AKP及ASM数量,抑制IL-1β、TNF-α及IL-6等促炎因子的产生,缓解小鼠因PM2.5致肺损伤的氧化应激反应。灰树花多糖能够提高肺组织中GSH-Px、CAT及SOD活性,降低PCG蛋白、MDA及8-OHd G含量。说明灰树花多糖能对因PM2.5造成肺受损小鼠起到机体保护作用。通过多糖抑制宫颈癌细胞(Hela细胞)、胃癌细胞的增殖效果评价了灰树花多糖体外抑制癌细胞的情况,观察多糖存在下对体外正常肝脏细胞生长的影响。同时构建Lewis肺癌小鼠模型,观察在多糖的存在下对肺癌模型小鼠的影响。通过实验发现多糖有较好的抑制体内肿瘤细胞增殖的作用,能够有效恢复肺癌小鼠的体重、胸腺系数及脾脏系数,同时能激活肺癌小鼠中的巨噬细胞的活性,激发脾脏中淋巴细胞的活性及数量,能有效提高机体细胞因子的表达水平。说明灰树花多糖具有较强的体内抗肿瘤活性。通过构建环磷酰胺致小鼠产生免疫缺陷模型,分析了灰树花多糖对小鼠免疫能力的保护机理。结果表明,灰树花多糖能够恢复免疫抑制小鼠的心脏、脾脏、肝脏、胸腺及肾脏的脏器系数,提高小鼠体内巨噬细胞数量及能力,增加机体中NO的生成量,刺激淋巴T细胞、淋巴B细胞的增殖,增加NK细胞及T细胞的毒理作用,提高小鼠血清中IL-2、IFN-γ、Ig G、Ig M及Ig A的细胞因子水平,增强总抗氧化的能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、GSH-Px、CAT及SOD活性,同时降低MDA的含量。灰树花多糖能够有效提高机体免疫功能发挥其抗氧化活性、抗菌抗肿瘤活性。该论文有图81幅,表32个,参考文献391篇。
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