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第一部分体外人ESCs蜕膜化模型的建立和鉴定目的:建立体外培养人子宫内膜基质细胞蜕膜化的模型,并鉴定蜕膜化模型的有效性。方法:人子宫内膜组织原代培养,采用8-Br-cAMP和MPA蜕膜化方法处理第四代ESC细胞,免疫组织化学技术检测原代培养细胞中波形蛋白和角蛋白的表达,显微镜下观察蜕膜化过程中细胞形态变化,化学发光法检测蜕膜化不同时间点细胞培养液中PRL水平。结果:1.原代培养细胞中波形蛋白在胞浆中表达强阳性,角蛋白无表达;2.蜕膜化第一天(D1)到第四天(D4) ESCs形态从长梭形逐渐变为圆形,细胞体积变大,胞核增大,细胞边界变模糊;3.化学发光法检测D1天到D4蜕膜化组培养液中PRL水平逐渐升高,D4天达到蜕膜化水平,对照组PRL水平无显著改变。结论:采用8-Br-cAMP和MPA蜕膜化方法处理ESCs在D4天达到成功蜕膜化水平,是研究体外蜕膜化过程的理想模型。第二部分体外人ESCs蜕膜化细胞周期及细胞周期芯片分析目的:研究在人ESCs体外蜕膜化过程中细胞周期分布的差异,以及芯片分析在蜕膜化过程中细胞周期相关基因的差异性表达。方法:采用8-Br-cAMP和MPA蜕膜化方法,分别选取体外蜕膜化0小时(D0)、24小时(D1)、48小时(D2)和96小时(D4),采用流式细胞分析仪分析细胞周期分布的改变;选取D0～D4的蜕膜化ESCs和对照进行细胞周期芯片分析,筛选蜕膜化过程中差异表达的细胞周期相关基因。结果:体外蜕膜化过程中ESCs发生G0/ 1到S期阻滞。体外蜕膜化ESCs蜕膜化0小时、24小时、48小时和96小时S期比例分别为18.2%、8.51%、3.34%和0.38%,G0/G1比例分别为65.7%、77.98%、84.88%和88.63%, G2/M比例分别为15.47%、13.51%、11.21%和10.99%。细胞周期芯片结果显示在D2与D0比较,差异倍数>2.0上调的基因有5个,差异倍数<0.50下调的基因有8个;在D4与D0比较,差异倍数>2.0上调的基因有4个,差异倍数<0.50下调的基因有7个。结论:TIMP3、CDKN1C、CUL4B、CDKN2B、CDK2、CCND1、CKS2、CDC6、CCNA2、CCNB 1、CDC20和CDC2可能在ESC脱离细胞周期走向分化过程中起着重要作用,但需进一步验证。第三部分人ESCs体外蜕膜化和非蜕膜化的micro-RNA芯片分析和蜕膜化相关靶基因的预测目的:研究在人ESCs体外蜕膜化与非蜕膜化中micro-RNA的差异性表达,并且对在蜕膜化过程中microRNA调节相关靶基因的预测。方法:采用8-Br-cAMP和MPA蜕膜化方法,选取体外蜕膜化D4和非蜕膜化C4组ESCs,进行microRNA芯片的检测,利用real-time PCR对芯片结果进行验证;采用生物信息学预测microRNA调节蜕膜化相关的靶基因,并进行功能分类。结果:芯片结果显示,蜕膜化与非蜕膜化ESCs比较分析,49个microRNA具有显著性差异,16个microRNA显著性上调,33个microRNA显著性下调;选取has-miR-27b, 30c, 143, 101,181b, 29b, 30d, 507, 107, 216, 139, 23a,222,221进行real-time PCR进行验证,其中has-miR-27b, 30c, 143, 101, 181b, 29b,30d, 507, 23a,222, 221具有显著性差异(P<0.05);生物信息学分析预测microRNA调节蜕膜化相关的靶基因,根据靶基因的功能分为六类:1,转录因子和DNA粘附蛋白;2,细胞外基质和相关分子;3,细胞内信号分子;4,细胞周期调节;5,生长因子,细胞因子受体和粘附蛋白;6,酶代谢相关分子。结论:在人子宫内膜蜕膜化过程中microRNA差异性表达,可能在蜕膜化过程中发挥了重要作用。第四部分Hsa-miR-222在人ESC蜕膜化过程中通过p57调节ESC细胞周期目的:本文通过转染hsa-miR-222 inhibitors下调hsa-miR-222,研究hsa-miR-222对人体外蜕膜化ESCs的细胞周期和p57的调节;并构建和共转染p57荧光素酶报告基因载体,研究has-miR-222对细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制蛋白(CKI) p57的表达调控。方法:构建合成2’-O-Me-222-inhibitors寡核苷酸、阴性对照和FITC连接的阴性对照,转染至体外培养的ESCs中,转染后6小时在荧光显微镜下观察荧光素的表达,判定转染效率,然后再进行体外蜕膜化48小时后采用流式细胞分析仪分析细胞周期,采用免疫印迹方法检测CDKN 1 C/p57kip2蛋白表达,比较转染和对照组细胞周期及CDKN 1 C/p57kip2蛋白的表达变化;构建pMIR-p57载体和对照,与hsa-miR-222inhibitors和对照共转染ESCs24小时后检测双荧光素酶活性,分析p57报告基因的表达。结果:ESCs转染hsa-miR-222 inhibitors后与对照组相比S期比例从10.93%下降至6.25%, G0/G1期比例从73.05%升高至77.52%;体外蜕膜化48小时ESCs转染hsa-miR-222 inhibitors后,S期比例从7.83%下降至3.34%, G0/G1期比例从74.94%升高至80.74%。转染hsa-miR-222 inhibitors后,Western blot检测ESCs中p57蛋白表达显著性升高(P<0.05); pMIR-p57载体和hsa-miR-222 inhibitors共转染ESCs后,与对照组相比荧光素酶的活性显著升高(P<0.05)。结论:在体外蜕膜化过程中,随着蜕膜化时间的增加ESCs的S期逐渐下降,G0/G1期逐渐升高,下调hsa-miR-222更显著降低S期的细胞数量和提高p57表达,从而抑制ESCs的生长,因此Hsa-miR-222在人ESC蜕膜化过程中可能是通过p57调节ESC细胞周期的变化。