棘球蚴病又称为包虫病,是由棘球属绦虫的幼虫(棘球蚴)寄生于人和多种食草类家畜引起的一种人兽共患病,其主要寄生部位为肝脏和肺脏。包虫病严重危害人类健康和畜牧业生产,为我国重点防治的重大疾病。由细粒棘球蚴寄生引起的囊型包虫病,在我国广泛流行,受危胁人口数、患病数和发病率居全球首位。树突状细胞(dendritic cells,DC)是一类功能最强的专职抗原提呈细胞,可有效启动初次免疫应答,在寄生虫感染时决定机体免疫应答方向。髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressorcells,MDSC)和调节性 T 细胞(regulatoryT cells,Treg)是两群主要引起免疫抑制作用的细胞,两者在细粒棘球绦虫原头节感染小鼠的外周血、腹腔和脾脏中明显富集。DC和MDSC可诱导Treg的产生,且DC可由MDSC分化产生。研究发现,寄生虫可释放携带多种生物活性物质(蛋白质、脂质和核酸等)的外泌体,参与寄生虫-寄生虫的信息交流,寄生虫-宿主的相互作用,在寄生虫感染致病过程中起重要作用。寄生虫源外泌体含有大量的miRNAs,可被宿主细胞摄取,进而调控宿主的免疫应答。然而,DC和抑制性细胞群(MDSC和Treg)在细粒棘球蚴感染小鼠的原发感染病灶肝脏的动态变化情况尚不清楚;原头节源外泌体及其含有的miRNAs在细粒棘球蚴感染致病过程中发挥的作用及机制尚未见报道。本研究建立细粒棘球蚴感染小鼠模型,利用流式细胞术检测小鼠感染早、中、晚期(3、6和12个月)肝脏白细胞DC、MDSC和Treg的比例动态变化情况。采用超速离心获得细粒棘球绦虫原头节源外泌体样囊泡(protoscoleces derived exosome like vesicles,PSC-ELVs)和囊液源外泌体样囊泡(hydatid fluid derived exosome like vesicles,HF-ELVs),进行高通量测序以及生物信息学分析,获得PSC-ELVs和HF-ELVs的ncRNAs(包括 miRNAs、lncRNAs 和 circRNAs)表达谱,对 PSC-ELVs 中含量前20的miRNAs进行筛选和鉴定,分析预测其潜在的靶基因,构建lncRNA-mRNA-miRNA调控网络,初步探索PSC-ELVs中最为丰富的miRNAs可能参与宿主的免疫调控和发病机制,为进一步研究这两种ELVs中miRNAs在寄生虫-宿主相互作用中的免疫调控功能提供理论基础。细粒棘球绦虫排泄分泌抗原(excretion-secretion antigens,ES)可调控DC的成熟和功能,影响炎症因子释放,调节Th1/Th2型免疫应答。外泌体是ES的重要组成部分,广泛参与核酸运输,细胞间物质交换和抗原递呈等。本研究通过将原头节源外泌体与骨髓来源的树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)共培养,分析其对BMDC表面MHCII分子和共刺激分子表达,以及细胞因子分泌的影响,探索原头节源外泌体及其含有的miRNAs对DC的功能及作用机制,为原头节源外泌体及其含有的miRNAs参与宿主免疫应答的作用提供理论及分子基础,也为包虫病临床诊断和基因治疗等研究提供新思路。一、细粒棘球蚴感染小鼠树突状细胞和免疫抑制细胞群比例动态变化研究建立细粒棘球蚴感染Balb/c小鼠模型,每只感染组小鼠腹腔注射2 000个原头节,对照组腹腔注射等量生理盐水。小鼠感染后3、6和12个月(感染早、中、晚期)收集肝脏白细胞,采用流式细胞术检测小鼠肝脏白细胞中DC、MDSC及其亚型M-MDSC、PMN-MDSC与Treg细胞的比例;动态分析感染小鼠肝脏DC和免疫抑制细胞群(MDSC和Treg)比例的变化。结果显示,小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中DC细胞比例分别为(5.27±0.55)%、(6.87±0.32)%和(18.5±0.64)%,对照组分别为(5.92±0.43)%、(5.99±0.12)%和(13.73±0.22)%,感染后6和12个月两组差异均有统计学意义(P均<0.05)。小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中MDSC 比例分别为(1.61±0.36)%、(5.68±0.69)%和(16.18±0.69)%,对照组分别为(2.19±0.42)%、(0.99 ±0.07)%和(4.18±0.84)%,感染后6和12个月两组差异均有统计学意义(P均<0.01);小鼠感染后3、6和12个月后肝脏白细胞中M-MDSC 比例分别为(0.69±0.27)%、(5.30±0.72)%和(10.75±0.29)%,对照组分别为(0.42± 0.24)%、(0.69±0.02)%和(2.12±0.13)%,感染后 6 和 12 个月两组差异均有统计学意义(P均<0.01);小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中PMN-MDSC 比例分别为(0.93 ± 0.23)%、(0.32±0.02)%和(5.14±1.03)%,对照组分别为(1.77±0.26)%、(0.28±0.05)%和(1.99±0.90)%,感染后3和12个月两组差异均有统计学意义(P均<0.05)。小鼠感染后3、6和12个月肝脏白细胞中Treg细胞比例分别为(3.35 ± 0.14)%、(6.24±0.38)%和(3.41±0.07)%,对照组分别为(3.48±0.46)%、(3.65±0.45)%和(3.12±0.12)%,感染后6和12个月两组差异均有统计学意义(P均<0.01)。小鼠感染原头节6和12个月后,肝脏白细胞中DC、MDSC与Treg细胞比例增加;其中MDSC比例变化更明显,以M-MDSC为主;同时可由M-MDSC分化形成的DC也明显升高,提示M-MDSC可能在小鼠感染细粒棘球蚴中后期发挥主要免疫抑制作用,且可能促进DC的产生。二、细粒棘球绦虫原头节源外泌体非编码RNA表达谱分析通过对细粒棘球绦虫原头节(protoscoleces,PSCs)的培养液和绵羊可育囊的囊液(hydatid fluid,HF)进行超速离心获得PSC-ELVs和HF-ELVs。使用透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析和Western blotting,对分离获得的两种外泌体进行鉴定,其大小,形态与外泌体一致,且含有特定的外泌体标记物。采用高通量测序分析了两种ELVs的ncRNAs(包括miRNAs、lncRNAs和circRNAs)表达谱,并利用GO和Pathway对PSC-ELVs中含量前20的miRNAs功能进行预测。在PSC-ELVs和HF-ELVs中,分别鉴定出1 18和58个miRNAs,两者共表达的miRNAs共有53个,其中PSC-ELVs特异表达65个,HF-ELVs特异表达5个。在PSC-ELVs和HF-ELVs分别鉴定出2 361和1 254个lncRNAs,其中两者共表达的lncRNAs共有1 004个,PSC-ELVs特异表达1 357个,HF-ELVs特异表达250个。PSC-ELVs中含量前20的miRNAs和circRNAs的表达量高于HF-ELVs中相应的miRNAs和circRNAs,而lncRNAs的表达量则低于HF-ELVs。通过荧光定量PCR检测,对miRNAs测序结果进行验证。此外,从PSC-ELVs含量前20的miRNAs中筛选出与宿主免疫应答有关的miRNAs,及其调控的lncRNAs 和 mRNAs,并构建了一个包含 5 个 miRNAs,41 个 lncRNAs 和 23 个mRNAs的ceRNA调控网络。PSC-ELVs含量前20的miRNAs的靶基因可能参与调控寄生虫感染过程中的炎症反应、MAPK级联反应和胶原分解代谢过程。此外,egr-miR-4989-3p 为 PSC-ELVs 和 HF-ELVs 中含量最高的 miRNA,与 egr-miR-277a-3p同属一个miRNA家族,具有相同的种子序列。本研究为首次鉴定获得PSC-ELVs和HF-ELVs中的ncRNAs谱,可能与宿主免疫应答和发病机理有关。这两种外泌体中含量丰富的miRNAs可能介导相关信号通路或与靶基因相互作用方式,在外泌体参与寄生虫-宿主相互作用中发挥重要的免疫调控作用。三、细粒棘球绦虫原头节源外泌体miRNA作用于树突状细胞的功能与机制研究通过将PSC-ELVs与BMDC共孵育,激光共聚焦显微镜观察发现PSC-ELVs可被BMDC内化摄取,qRT-PCR检测发现PSC-ELVs能将携带的miRNAs转运至BMDC中。通过qRT-PCR和ELISA分别检测处理后的BMDC细胞因子mRNA和蛋白质水平的表达,流式细胞术检测BMDC表面MHCⅡ类分子和共刺激分子表达水平,结果发现PSC-ELVs可有效诱导BMDC产生促炎性因子IL-6、IL-12、TNF-α、IL-β、IFN-γ和抑炎性因子IL-10,且大多数与LPS存在协同作用,上调细胞表面MHC Ⅱ分子和共刺激分子CD80、CD86、CD40、PDL1和PDL2的表达,这一结果提示PSC-ELVs可能携带某些毒力分子诱导BMDC成熟且往刺激型DC极化,呈现明显的促炎特性,可能产生Th1型细胞介导的免疫应答,有助于杀伤并清除入侵的病原体而保护机体。将miR-277a-3p和miR-4989-3p的mimic 和 inhibitor 转染 BMDC 后,qRT-PCR 检测发现,miR-277a-3p 和 miR-4989-3p诱导BMDC促炎性因子IL-6、IL-12和TNF-α的mRNA水平显著增加,抑炎性因子IL-10的mRNA水平显著降低,提示miR-277a-3p和miR-4989-3p可诱导BMDC产生炎性因子,往刺激型DC极化。miR-277a-3p和miR-4989-3pmimic诱导BMDC IGF1和NF-κB1的mRNA水平显著降低,NF-κB P65的mRNA和蛋白质水平显著增加,并增加其磷酸化水平,提示IGF1和NF-κB1是miR-277a-3p和miR-4989-3p潜在的靶基因,可能通过活化NF-κB P65并使其磷酸化,进而诱导促炎性因子产生。本研究为进一步明确原头节源外泌体及其含有的miRNAs调控宿主免疫应答机制及包虫病防治研究提供新思路和分子基础。