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目的:构建携带小鼠、大鼠、人白蛋白启动子通用序列的腺病毒载体,研究其在三个种属的肝脏来源细胞、非肝脏来源细胞及干细胞诱导分化的肝细胞样细胞中对白蛋白的检测,为干细胞肝向分化状态的实时监测提供新的方法。方法:⑴.实验细胞:人肝癌细胞Hep G2、小鼠肝癌细胞Hepa1-6培养基选用含10%FBS的DMEM培养基。采用原位两步胶原酶灌流法进行大鼠原代肝细胞的分离及纯化,获得的原代肝细胞在无血清培养基中进行胶原-Matrigel三明治夹心培养。SD大鼠MSC生长培养基培养第6-8代大鼠BM-MSCs。取第4-6代小鼠BM-MSCs,采用C57BL/6小鼠MSC生长培养基。所有细胞培养条件均为37℃,5%CO2,饱和湿度。在对数生长期时进行细胞传代,24小时后,细胞密度为50–70%转染重组质粒或病毒。⑵.构建重组质粒p DRIVE-SV40-Albp-Lac Z及质粒转染:根据(1)启动子数据库预测白蛋白启动子长1000bp,位于-700/+299;(2)表达载体容量;(3)转录因子结合位点,从Gene Bank BLAST中获得三段人白蛋白启动子片段,然后将这三段启动子片段送至汉恒生物分别制得转染重组质粒p DRIVE-SV40-Albp-Lac Z的三种GT100 E.coli,扩增E.coli,提取质粒,分光光度计测量质粒DNA的浓度。三种重组质粒脂质体法转染Hepa1-6,显微镜观察加入X-gal后各组细胞蓝色沉淀的生成。利用Image-pro Plus 6.0软件,人工计算蓝染细胞比率。⑶.构建SV40-Albp-Zs Green腺病毒载体并感染肝脏及非肝脏来源细胞:从上述重组质粒转染Hepa1-6试验中,获得-173/+36(210bp,Fragment 3)为白蛋白启动子转录活性最高的片段。依据质粒p DRIVE-SV40-Albp-Lac Z转染Hepa1-6实验结果,SV40增强子与白蛋白启动子的连接可有效调控Lac Z基因的表达,所以在构建腺病毒载体时我们也采用SV40增强子与白蛋白启动子连接,以保证白蛋白启动子的转录活性。SV40增强子与白蛋白启动子连接片段(SV40-Albp)序列由汉恒生物提供,从Gene Bank中获得Zs Green序列。按照引物设计的原则设计SV40-Albp及报告基因Zs Green引物,人工合成SV40-Albp片段及Zs Green。亚克隆至切除启动子的表达载体p HBAd-U6-CMV的Xba I/Mlu I酶切位点。连接产物转化感受态E.coli DH5α,筛选含有目的基因的表达质粒p HBAd-SV40-Albp-Zs Green阳性克隆,经酶切、测序鉴定正确后,和骨架质粒p HBAd-BHG脂质体法转染人胚肾细胞系HEK293细胞进行病毒包装、扩增、并检测病毒滴度。SV40-Albp-Zs Green腺病毒载体感染肝脏及非肝脏来源细胞,倒置荧光显微镜观察Zs Green基因的表达,并以CMV-GFP腺病毒载体作为阳性对照。同时进行细胞爬片,免疫荧光染色检测各细胞ALB表达。⑷.SV40-Albp-Zs Green腺病毒载体感染肝向分化的小鼠BM-MSCs:采用两步法诱导方案(第一步:20 ng/ml HGF+10 ng/ml b FGF+0.61g/ml NAM培养7天,第二步:20 ng/ml OSM+1umol/L DXM+50mg/ml ITS 14天)诱导小鼠BM-MSCs向肝细胞样细胞分化。21天后,SV40-Albp-Zs Green腺病毒载体感染肝向分化的细胞,倒置荧光显微镜观察Zs Green基因的表达,并以CMV-GFP腺病毒载体作为阳性对照。同时,肝向分化的细胞爬片,免疫荧光染色检测ALB表达。结果:⑴.重组质粒p DRIVE-SV40-Albp-Lac Z的构建及转录活性最高的ALB启动子片段筛选:从Gene Bank BLAST中获得三段人白蛋白启动子片段-247/+36(284bp,Fragment 1),-173/-23(151bp,Fragment 2)和-173/+36(210bp,Fragment 3),并成功构建三种重组质粒p DRIVE-SV40-Albp-Lac Z,转染Hepa1-6,细胞中均有蓝色沉淀生成。Fragment 3所在质粒组细胞蓝染比率最高。选取Fragment 3用于下一步实验。⑵.SV40-Albp-Zs Green腺病毒载体的构建及对各组细胞ALB的检测:经酶切及测序明确携带SV40-Albp和Zs Green基因的SV40-Albp-Zs Green腺病毒载体构建成功,TCID 50测定病毒的感染滴度2×1010 PFU/m L,感染肝脏来源细胞,显微镜下均可见不同程度的绿色荧光,非肝脏来源细胞无绿色荧光表达。阳性对照组中,均出现高亮度的绿色荧光。免疫荧光染色显示,ALB表达与Zs Green绿色荧光蛋白表达趋势一致。⑶.SV40-Albp-Zs Green腺病毒载体对小鼠BM-MSCs肝向分化细胞ALB的检测:成功培养出小鼠BM-MSCs,接种第4-6代后。21天诱导后,SV40-Albp-Zs Green腺病毒载体感染的肝细胞样细胞于倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白的表达,阳性对照组中,可观察到高亮度的绿色荧光。免疫荧光染色检测的ALB表达与Zs Green绿色荧光蛋白表达趋势一致。结论:⑴.小鼠、大鼠、人白蛋白启动子通用序列中-173/+36(210bp)片段转录活性最高。⑵.成功构建携带小鼠、大鼠、人白蛋白启动子通用序列-173/+36(210bp)的SV40-Albp-Zs Green腺病毒载体。⑶.SV40-Albp-Zs Green腺病毒载体可用于小鼠、大鼠、人干细胞肝向分化状态的实时监测。