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肠球菌虽然是人类和动物肠道正常菌群的重要组成部分,但在医学临床和兽医临床完全证实具有致病性。肠球菌广泛的致病性除了与其独特的耐药性有关外,众多的毒力因子也发挥着重要作用。在众多毒力因子中其一系列的表面蛋白在细菌对宿主细胞的粘附、定殖以及致病性方面发挥着重要作用。本研究在前期工作基础上,以致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11为亲本株,应用同源重组的方法构建新筛选出的表面蛋白EF3183基因突变株,培养He La及RAW264.7细胞,通过观察突变株对He La细胞的粘附能力和EF3183单抗的粘附抑制、小鼠RAW264.7细胞的侵染能力、小鼠主要脏器的载菌能力以及对BF形成能力的影响。来阐述新筛选的表面蛋白EF3183在XJ11株致病过程中的作用,为进一步阐明粪肠球菌的致病机理提供有用数据。现将试验结果报告如下:1、致羔羊脑炎粪肠球菌表面蛋白基因的检测:根据致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05全基因组测序的结果,设计特异性引物,采用PCR扩增检测表面蛋白EF1092、EF1269、EF2224、EF2505、EF3183在11株致羔羊脑炎粪肠球菌中的分布情况。结果发现五种表面蛋白在11株致羔羊脑炎粪肠球菌中广泛分布,除XJ09只含有EF2224外,其余10株菌中均含有五种表面蛋白。2、致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11株EF3183基因的克隆与生物信息学分析:采用PCR方法扩增EF3183基因,将阳性克隆进行测序,用生物信息学软件预测期功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获得了长1060 bp的表面蛋白EF3183基因;经生物信息学分析,此序列包含有一个1056 bp的完整开放阅读框,编码351个氨基酸;无信号肽;有2个跨膜区;抗原表位预测显示表面蛋白EF3183有15个抗原表位;系统进化树分析显示致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11株表面蛋白EF3183基因与粪肠球菌v583的EF3183基因的进化距离最近。3、致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11-Δ3183突变株的构建:应用同源重组技术构建XJ11的EF3183基因突变株,使用Primer 5设计引物,扩增出用于失活表面蛋白EF3183基因的插入序列,酶切、回收该基因序列,并与酶切后的穿梭质粒进行连接后,电转化至E.faecalis XJ11的感受态细胞中。使用卡那霉素抗性筛选出阳性转化子,并采用PCR等方法进行鉴定。最终成功得到基因突变株E.faecalis XJ11-Δ3183。4、E.faecalis XJ11-Δ3183在细胞粘附、特异性单抗粘附抑制、侵染及脏器载菌量研究:以E.faecalis XJ11为对照组,E.faecalis XJ11-Δ3183为实验组,分别于粘附He La细胞1 h和2 h后裂解细胞,在E.faecalis XJ11粘附He La细胞前加入抗表面蛋白EF3183的单克隆抗体,裂解细胞涂平板后进行细菌计数;于细菌侵染小鼠RAW264.7细胞4 h和24 h后,裂解细胞,涂平板进行细菌计数;在不同时间人工感染小鼠,取肝小叶、脾脏、左肾和心脏组织匀浆,匀浆液稀释后涂平板统计细菌数计算小鼠脏器载菌量。结果显示与野毒株比较,EF3183突变株的对He La细胞粘附数量明显下降,且差异极显著(P<0.001)。加入单抗的E.faecalis XJ11对He La细胞粘附数量明显出现下降,且差异极显著(P<0.001)。侵染小鼠RAW264.7细胞细菌数量变化不明显,且差异不显著(P>0.05)。感染小鼠6 h、12 h和24 h后,突变株在小鼠肝小叶、脾脏、左肾的载菌量下降明显,且差异极显著(P<0.01);在心脏的载菌量下降明显,且差异显著(P<0.05)。5、E.faecalis XJ11-Δ3183生物被膜形成能力的研究:将E.faecalis XJ11和E.faecalis XJ11-Δ3183在分别置于37℃条件下于96孔板中培养8 h、18 h、24 h、36 h和48 h,经1%结晶紫染色后,测定各个孔的吸光度。同时用孔底放有盖玻片的六孔板培养细菌,经刀豆蛋白A或PI染色后,将盖玻片取出后用激光共聚焦显微镜下观察生物被膜的形态结构。结果显示E.faecalis XJ11所形成生物被膜的吸光度明显高于E.faecalis XJ11-Δ3183,统计学分析差异显著(P<0.05);野毒株生物被膜基质中形成的多糖数量更多且结构致密,其中包埋的细菌呈现区域化的分布,而E.faecalis XJ11-Δ3183在气液交界面形成完整的生物被膜不够完整。