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抗CD20单克隆抗体Rituximab是美国FDA批准的第一个用于淋巴瘤治疗的单克隆抗体药物。Rituximab用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)已经获得了令人鼓舞的疗效,但仍有部分的患者对Rituximab治疗不产生反应,而且在使用Rituximab治疗后大部分患者会产生复发和抵抗。因此寻求更为有效的治疗NHL的药物尤为迫切。人类白细胞抗原(HLA-DR)在多种造血系统恶性肿瘤中高表达,引起人们探索用抗HLA-DR单克隆抗体靶向治疗淋巴瘤的兴趣。hL243γ1是一种抗HLA-DR α链表位的人源化IgG1单克隆抗体。有研究报道,hL243γ1可通过诱导细胞死亡的机制直接杀伤肿瘤细胞。而Rituximab作为Ⅰ型抗CD20单克隆抗体,诱导细胞死亡的能力较弱。CD20和HLA-DR都表达于B细胞淋巴瘤细胞表面,有证据表明二者在部位及功能上关系密切。研究表明,抗CD20单克隆抗体和抗HLA-DR单克隆抗体联合用药比单独用药更有效。双特异性抗体(bispecific antibody, BsAb)可以同时特异性结合两个不同的抗原,由于其双特异性和多功能性,在肿瘤免疫治疗中的作用越来越重要。BsAb自然状态下不存在,只能通过人工方法进行制备。基因工程抗体技术的发展,为研发不同类型的BsAb奠定了基础。研究目的：我们拟构建靶向CD20和HLA-DR分子的BsAbs,包括靶向CD20和HLA-DR分子的DVD-Ig和靶向CD20和HLA-DR分子的crossmab两个BsAbs结构,以期获得更为有效的治疗NHL的靶向抗体药物。研究方法：1.设计靶向CD20和HLA-DR分子的DVD-Ig,命名为CD20-HLA-DR DVD-Ig,利用基因工程抗体技术构建DVD-Ig重、轻链的真核表达载体。2.利用FreeStyle293-F Cells哺乳动物细胞表达体系,表达CD20-HLA-DR DVD-Ig,并进行鉴定。3.设计靶向CD20和HLA-DR分子的CrossMab,命名为CD20-HLA-DR CrossMabCH1-CL,利用基因工程技术构建Crossmab的四条链的真核表达载体。4.利用FreeStyle293-F Cells哺乳动物表达体系,表达CD20-HLA-DR CrossMabCH1-CL,并进行鉴定。5.体外研究验证CD20-HLA-DR DVD-Ig和CD20-HLA-DR CrossMabCH1-CL与靶细胞的结合能力。6.体外研究验证CD20-HLA-DR DVD-Ig和CD20-HLA-DR CrossMabCH1-CL诱导同质性粘附,直接介导细胞死亡的活性。研究结果：1.设计连接CD20-HLA-DR DVD-Ig重、轻链两个可变区的linker序列,构建了CMV/R-IgG1/CD20-HLA-DR DVD-Ig HC和CMV/R-IgKappa/CD20-HLA-DR DVD-Ig LC真核表达载体。2.将CMV/R-IgG1/CD20-HLA-DR DVD-Ig HC和CMV/R-IgKappa/CD20-HLA-DR DVD-Ig LC瞬时共转染FreeStyleTM293-F细胞,培养细胞纯化培养上清得到目的蛋白。3.基于‘’knobs-into-holes"技术(“杵臼”技术)和‘’crossover"技术(“交叉”技术),设计或改造CD20-HLA-DR CrossMabCH1-CL的四条链,构建了CMV/R-IgG1/HC(1)、CMV/R-IgKappa/LC(1)、CMV/R-IgG1/HC(2)、 CMV/R-IgKappa/LC(2)真核表达载体。4.将CMV/R-IgG1/HC(1)、CMV/R-IgKappa/LC(1)、CMV/R-IgG1/HC(2)、 CMV/R-IgKappa/LC(2)瞬时共转染FreeStyleTM293-F细胞,培养细胞纯化培养上清得到目的蛋白。5. CD20-HLA-DR DVD-Ig和CD20-HLA-DR CrossMabCH1-CL均可与淋巴瘤细胞系Raji细胞表面抗原结合,CD20-HLA-DR DVD-Ig和CD20-HLA-DR CrossMabCH1-CL结合Raji细胞表面抗原效应明显高于Rituximab和hL243yl单独用药。6. CD20-HLA-DR DVD-Ig和CD20-HLA-DR CrossMabCH1-CL均可诱导同质性粘附,直接诱导细胞死亡,且诱导细胞死亡能力高于Rituximab和hL243γ1单独作用。结论：本实验首次成功构建并鉴定了靶向CD20和HLA-DR分子的两种类型的BsAbs: CD20-HLA-DR DVD-Ig和CD20-HLA-DR CrossMabCH1-CL,二者均可通过标准化的方法获得与全抗体相似的亲和力和稳定性。CD20-HLA-DR DVD-Ig和CD20-HLA-DR CrossMabCH1-CL可同时结合B细胞淋巴瘤细胞表面的CD20和HLA-DR分子,诱导同质性粘附,直接介导细胞死亡,比Rituximab和hL243γ1单独用药具有更高的直接杀伤细胞的能力。