结直肠癌是严重危害人类健康的常见消化道恶性肿瘤之一。在我国由于结直肠癌的发病率逐渐增加,并且其发病年龄趋向低龄化,因此人们对结直肠癌发生机制的研究日益增加。腺瘤是结直肠癌发生的早期阶段,多数结直肠癌是从腺瘤癌变而来的,因此切除腺瘤可以有效地降低结直肠癌的发病率。然而,约30%～46%的腺瘤患者在接受治疗后2.5-7年内仍会复发,原因在于目前尚缺乏有效的指标来预测腺瘤的进一步演进或复发。因此对结直肠腺瘤发生机制的研究对于结直肠癌的预防及治疗具有重大意义。尽管人们对结直肠癌发生的分子机理进行了大量的研究,但至今结直肠癌的发生发展的分子机制仍不清楚。早在1999年,我们实验室应用抑制性消减杂交法(SSH)(利用一个同时患有结肠腺瘤和腺癌的病例)构建了三个cDNA差减文库,在对腺瘤相对于正常粘膜的差异片段文库(A-N)分析时发现再生基因家族成员RegⅣ在腺瘤中相对高表达。再生基因(Regenerating gene, Reg)家族属于C型植物血凝素超家族。该基因家族成员,均为小分子量的分泌性蛋白质,在结构上具有相似的钙离子依赖性血凝素结构域。它们与炎症、组织损伤／修复、糖尿病及恶性肿瘤的发生发展有关。迄今为止,已经发现的人类Reg家族成员一共有3个,即Reg Ⅰ, RegⅢ及RegⅣ。与其他人类Reg家族成员不同的是,RegⅣ定位于第一号染色体上,而其余成员均定位于第二号染色体。但RegⅣ与Reg家族的其他成员在结构及功能上具有相似性。近年来人们已证实RegⅣ与结直肠癌的发生发展有关,然而RegⅣ在结直肠癌中的生物学功能及效应机制却研究的不多。为深入研究RegⅣ在结直肠癌发生发展中的作用,我们开展了以下两部分研究：RegⅣ在结直肠癌细胞中的生物学功能研究和RegⅣ在结直肠癌细胞中的效应机制研究。首先通过RT-PCR和Western blot方法寻找RegⅣ阴性和阳性表达的结直肠癌细胞系。实验结果显示RKO和HT29为RegⅣ阴性表达细胞株,LoVo和CW2为RegⅣ阳性表达细胞株。然后我们分别转染RegⅣ表达质粒到RegⅣ阴性表达的结直肠癌细胞内,通过G418筛选得到稳定表达RegⅣ的细胞克隆,分别记为RKO-RegⅣ细胞株(RKOR)和HT29-RegⅣ细胞株(HT29R),它们的对照组分别记为RKO-Ctrl (RKOC)和HT29-Ctrl细胞株(HT29C);转染RegⅣV干扰质粒至LoVo细胞株中,同样通过G418稳筛出RegⅣ稳定干扰的细胞克隆LoVo-RegⅣ-shRNA和它的对照组细胞克隆LoVo-Ctrl-shRNA;用siRNA片段瞬时干扰CW2细胞中RegⅣ的表达,它的RegⅣ干扰的细胞记为CW2-siRNA-RegⅣ,对照组细胞记为CW2-siRNA-NC.获得RegⅣ稳定表达/干扰的细胞克隆后,我们对这些细胞克隆进行生物学功能研究,通过EdU法、xCELLigence系统及CCK8方法检测RegⅣ表达/干扰前后细胞增殖能力变化,未发现RegⅣ具有促进细胞增殖的能力；通过外源性RegⅣ刺激细胞后同样发现RegⅣ未具有促进细胞增殖的能力；我们又利用流式细胞术检测细胞周期,结果显示并无显著差异。利用5-FU诱导细胞凋亡,分别在24小时和48小时检测细胞的存活率,发现这几组细胞的存活率也无明显差异。通过Transwell小室和xCELLigence系统检测到RegⅣ表达组细胞的迁移能力均强于它们的对照组细胞；而RegⅣ干扰组细胞的迁移能力比它们的对照组细胞有所下降。利用铺有Matrigel的Transwell小室检测细胞的侵袭能力,发现RegⅣ表达组细胞的侵袭能力强于它们的对照组细胞,干扰组结果反之。综上可知RegⅣ具有促进结直肠癌细胞迁移和侵袭能力,但未见对结直肠癌细胞的增殖和凋亡有影响。因此探索RegⅣ如何诱导结直肠癌细胞迁移和侵袭的分子机制是我们下一步所要开展的工作。比较蛋白质组学是当今生物学研究的一个重要领域,比较不同生理和病理状态下细胞内蛋白质表达和蛋白质修饰,对于揭示生物系统的复杂生理和病理过程具有十分重要的意义。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术。iTRAQ技术结合先进的液相色谱-质谱联用仪(liquid chromatography-mass spectrograph, LC-MS)对蛋白质样本的分离能力强、分析范围广、灵敏度高、可同时对多个样本进行平行分析并可以绝对和相对定量,因此iTRAQ技术结合LC-MS必将成为一种功能更强大的蛋白组学研究方法。因此我们选用iTRAQ标记的比较蛋白组学方法来探索RegⅣ在结直肠癌细胞中的效应机制,我们用该方法完成了对1985种蛋白质的定量分析。已鉴定出的表达量上有差异的蛋白质是否最终被筛选和认定为差异蛋白质,还需要进行统计学的验证。由于RKO和HT29细胞本身遗传背景不同,因此它们所得的差异蛋白质结果也存在差异。通过统计学分析后,所产生的差异蛋白质的筛选结果如下：RKOR/RKOC组鉴定出6个显著下调和11个显著上调的蛋白质,HT29R/HT29C组鉴定出18个显著下调和13个显著上调的蛋白质。因为肿瘤的转移过程是多基因、多途径的过程,因此不同遗传背景的细胞所得的实验结果可以为RegⅣ分子机制研究提供更多的信息和线索。我们利用GO数据库对鉴定出的所有差异蛋白进行GO功能注释分析,利用蛋白相邻类的聚簇(cluster of Orthologous Groups of proteins, COG)对蛋白质进行直系同源分类,利用KEGG公共数据库分析、确定蛋白质参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。最后我们用Q-PCR检测了]RKOR/RKOC组中15个差异基因和HT29R/HT29C组18个差异基因的表达情况,其中RKOR/RKOC组中的12个差异基因和HT29R/HT29C组中的14个差异基因的Q-PCR结果与iTRAQ鉴定的结果一致。我们又用Western blot验证了MRPL12、MAGED2、DBN1、TIP47、 MAPK3和S100A11的表达情况,结果均与iTRAQ鉴定的蛋白质结果一致,因此本实验用iTRAQ鉴定的差异蛋白质信息是可靠的。这些蛋白质可能作为RegⅣ在结直肠癌中发挥其生物学功能的效应分子,对这些效应分子的进一步研究将为阐明RegⅣ在结直肠癌细胞中的分子机制奠定基础。