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第一部CSE对肺微血管内皮细胞凋亡和Notch信号表达的影响目的:研究香烟烟雾提取物(Cigarette smoking extract,CSE)干预对人肺血管内皮细胞(Human pulmonary microvascular endothelial cell,HPMEC)凋亡的影响以及CSE能否影响HPMEC中Notch信号的表达。方法:体外培养HPMEC,分别使用不同浓度的CSE(0%,0.5%,1%,2.5%,5%)干预12h以及1%CSE干预不同时间(0,3h,6h,12h,24h),采用Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞技术检测细胞凋亡率。将HPMEC分为对照组和CSE组,后者分别使用1%CSE干预6h、12h、24h,采用Real-time PCR检测各组Notch1、Notch2、Notch3、Notch4及其靶基因Hes1、Hey2的m RNA表达。使用CSE对HPMEC干预24h,采用Western Blot检测CSE干预前后Notch1、Notch2、Notch4及其靶基因Hes1、Hey2蛋白表达。使用SPSS17.0统计软件包进行数据分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果:(1)CSE干预12h,与对照组比较,0.5%CSE即引起HPMEC凋亡增加(P<0.05),在0.5%~2.5%浓度范围内,随着CSE浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增高,当浓度达到5%时,细胞凋亡率较2.5%组下降(P<0.05),但坏死逐渐明显。(2)选择细胞凋亡率增长最快同时坏死率相对较低的1%CSE作为最佳干预浓度,使用1%CSE干预不同时间,与对照组比较,各CSE组细胞凋亡率均较对照组显著升高,且在3h~12h范围内,随着干预时间的延长,细胞凋亡率逐渐增多,当干预时间达到24h时,细胞凋亡率与12h无显著差异(P>0.05)。(3)CSE干预6h,Notch1、Notch4 m RNA表达较对照组增加(P<0.05);干预12h,Notch1、Notch4 m RNA表达与对照组比较无统计学差异(P>0.05);干预24h时Notch1、Notch4 m RNA及蛋白表达均较对照组显著下降(P<0.05)。(4)CSE干预6h,Notch2m RNA表达与对照组无统计学差异(P>0.05);干预12h,Notch2m RNA表达与对照组比较亦无统计学差异(P>0.05);干预24h时Notch2m RNA及蛋白表达均较对照组显著增加(P<0.05)。(5)CSE干预6h,Hes1、Hey2 m RNA表达与对照组比较无统计学差异(P>0.05);随着干预时间的延长,Hes1、Hey2 m RNA表达逐渐下降,至干预24h时,Hes1、Hey2 m RNA表达较对照组显著下降(P<0.05)。结论:(1)CSE可诱导HPMEC的凋亡,并呈浓度依赖性和时间依赖性。(2)CSE可以抑制Notch1、Notch4表达,促进Notch2表达。(3)CSE可能通过影响Notch信号及其靶基因的表达参与HPMEC凋亡。第二部分Notch1在CSE诱导的肺微血管内皮细胞凋亡中的保护作用目的:研究Notch1是否对CSE诱导的HPMEC凋亡起到保护作用。方法:构建Notch1过表达质粒,并使用慢病毒包装。以Notch1过表达慢病毒转染HPMEC,并使用1%CSE干预24h。将HPMEC分为五个处理组:空白对照组,过表达组,阴性病毒组,CSE+过表达组,CSE+阴性病毒组。Real-time PCR和Western Blot检测各组Notch1 m RNA和蛋白的表达。流式细胞技术检测各组细胞凋亡率。使用SPSS17.0统计软件包进行数据分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果:(1)过表达组Notch1的表达水平显著高于空白对照组和阴性病毒组(P<0.05);阴性病毒组Notch1的表达与空白对照组无统计学差异(P>0.05);CSE干预后,过表达组和阴性病毒组Notch1的表达均较干预前下降(P<0.05),但CSE+过表达组仍高于CSE+阴性病毒组(P<0.05)。(2)过表达组细胞凋亡率与空白对照组无显著差异(P>0.05),均显著低于阴性病毒组(P<0.05)。CSE干预后,过表达组和阴性病毒组细胞凋亡率均较未干预前明显增高(P<0.05),但过表达组细胞凋亡率仍显著低于阴性病毒组(P<0.05)。结论:Notch1对CSE诱导的HPMEC凋亡起到保护作用。第三部分Notch1通过ERK途径抑制肺微血管内皮细胞凋亡目的:探讨Notch1是否通过ERK途径参与CSE诱导的HPMEC凋亡。方法:体外培养HPMEC,首先检测CSE干预前后ERK1、ERK2的变化,将HPMEC分为对照组和CSE组;其次检测Notch1过表达对ERK1、ERK2的影响,将HPMEC分为五个处理组:空白对照组,过表达组,阴性病毒组,CSE+过表达组,CSE+阴性病毒组;最后检测抑制ERK对Notch1的影响以及对细胞凋亡的影响,将HPMEC分为四个处理组:空白对照组,CSE组,PD98059组,CSE+PD98059组。采用Real-time PCR和Western Blot分别检测ERK1、ERK2、Notch1 m RNA和蛋白的表达。流式细胞技术检测各组细胞凋亡率。使用SPSS17.0统计软件包进行数据分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果:(1)CSE干预6h,ERK1m RNA表达与对照组无统计学差异(P>0.05);随着干预时间的延长,ERK1表达水平逐渐升高,至干预24h时,无论ERK1m RNA还是蛋白表达均较对照组显著增加(P<0.05)。(2)CSE干预6h,ERK2m RNA表达较对照组增加(P<0.05);随着干预时间的延长,ERK2表达水平逐渐升高,至干预24h时,无论ERK2m RNA还是蛋白表达均较对照组显著增加(P<0.05)。(3)过表达组ERK1和ERK2的表达水平均显著低于空白对照组和阴性病毒组(P<0.05);阴性病毒组ERK1和ERK2的表达与空白对照组无统计学差异(P>0.05);CSE干预后,过表达组和阴性病毒组ERK1和ERK2的表达均较干预前升高(P<0.05),但CSE+过表达组仍低于CSE+阴性病毒组(P<0.05)。(4)与对照组比较,CSE组、PD98059组、CSE+PD98059组Notch1的表达水平均显著下降(P<0.05),但该三组之间比较无统计学差异(P>0.05)。(5)与对照组比较,CSE组细胞凋亡率明显增加(P<0.05),而CSE+PD98059组细胞凋亡率显著低于CSE组。结论:CSE可以通过抑制Notch1的表达,进而激活ERK途径,最终导致HPMEC凋亡。