随着工业的发展和人口的增加,资源短缺和环境污染成为困扰人类发展的两个重要难题。进入新世纪以来化石资源日益枯竭,开发清洁的的可再生能源已成为人们的迫切需要。以纤维素为主要成分的生物质资源是地球上含量最丰富的可再生资源,对纤维素资源的开发利用越来越受到人们的重视。但由于纤维素结构致密、不溶于水、本身存在结晶区等原因,纤维素的生物转化效率很低。因此研究纤维素的生物降解途径,提高生物转化的效率是纤维素资源利用的前提条件。Cytophaga hutchinsonii是拟杆菌门（Bacteroidetes）一种好氧的革兰氏阴性细菌。C.hutchinsonii 可以快速彻底地降解结晶纤维素,但其既不分泌游离的纤维素酶也没有纤维小体结构,同时纤维素酶系中没有内切纤维素酶存在,纤维素酶也不含有CBM结构。因此C.hutchinsonii的纤维素降解机制不同于已知的好氧微生物游离纤维素酶机制以及厌氧微生物的纤维小体降解机制,可能是一种全新且未知的降解机制。对这种高效的结晶纤维素降解机制的研究有助于提高人们对纤维素降解机制的认识,并对纤维素生物转化利用提供帮助。之前由于C.hutchinsonii遗传操作体系的不成熟,对其纤维素降解机制研究进展十分缓慢。近年来C.hutchinsonii遗传操作体系的不断发展为纤维素降解机制的研究奠定了基础。纤维二糖是纤维素的结构的基本组成单位,并且纤维二糖还是纤维素降解的重要中间产物。因此探究C.hutchinsonii对纤维二糖的降解及利用过程对C.hutchinsonii纤维素降解机制的研究有重要意义。本文通过基因敲除等手段探究C.hutchinsonii的四个β-葡葡糖苷酶各自的功能及其在纤维素降解中作用。同时利用离子色谱手段对纤维寡糖和纤维素降解过程的中间产物进行检测,以期望可以探寻C.hutchinsonii纤维素的降解途径。采用新的吸附蛋白提取方法鉴定出一批C.hutchinsonii的吸附蛋白,研究了纤维素诱导吸附蛋白CHU₀344的功能。同时利用转座子插入突变方法筛选到一株色素缺失菌株,研究了 flexirubin色素多烯链合成中关键β-羟酰-ACP脱水酶的作用以及flexirubin色素的生物学功能。具体内容及结果如下:1.C.hutchinsonii β-葡萄糖苷酶功能及其对纤维素降解的影响,C.hutchinsonii纤维素降解产物检测及其双途经降解体系。我们研究了C.hutchinsonii β-葡萄糖苷酶的功能,及其在纤维素降解中的作用。同时首次研究发现C.hutchinsonii存在细胞表面纤维素降解途径,并证实C.hutchinsonii存在细胞内降解途径,从而提出新的双途径降解模型。β-葡萄糖苷酶在纤维素降解过程中主要起到降解中间产物纤维二糖的作用。同时有部分β-葡萄糖苷酶具有转糖基作用。C.hutchinsonii经过基因组分析预测发现有四个β-葡萄糖苷酶基因:bglA（chu₂268）、bglB（chu₂273）、bglC（chu₃577）和bglD（chu₃784）。所有的四个β-葡萄糖苷酶都属于糖苷水解酶GH3家族,其中BglA,BglB,BglC被预测为脂蛋白。通过SignalP4.1预测发现只有BglB含有信号肽,但是BglA,BglC和BglD蛋白的前30位氨基酸均含有大量的疏水性氨基酸,因此推测在这些蛋白中同样含有信号肽。为研究四个β-葡萄糖苷酶在纤维二糖和纤维素降解中各自起的作用,首先检测野生菌株中在不同培养条件下四个酶在RNA水平和蛋白水平的表达情况。通过荧光定量PCR和蛋白活性电泳检测,发现在葡萄糖培养条件下只有bglB基因存在表达。在纤维二糖或纤维素培养条件下BglA和BglB都存在表达,但BglA的表达水平远低于BglB。BglC的两种条件下表达水平都很低,而BglD现有的实验条件下检测不到表达。因此我们推测BglA和BglB在C.hutchinsoni 纤维二糖和纤维素降解中期关键作用。随后我们通过同源双交换重组技术对四个β3-葡萄糖苷酶进行基因敲除,得到单敲除菌株△ bglA、△bglB、和△bglD 同时对主要的β-葡萄糖苷酶进行多敲除得到△bglA/hglB和△bglA/bglB/bglC突变株。表型检测发现单敲除菌株中有△bglB在纤维二糖和纤维素培养时存在延迟,其它单敲除菌株不受影响。但双敲除菌株和三敲除菌株丧失降解纤维二糖和纤维素的能力。酶活检测发现在葡萄糖培养条件下单独敲除bglB后菌体丧失全部β-葡萄糖苷酶酶活,而在纤维素培养条件下敲除bglB后菌体保留20%的酶活,但△ bglA/bglB丧失所有酶活,其它单敲除菌株不会影响菌体的β-葡萄糖苷酶酶活。同时检测菌体的纤维二糖降解能力,发现△bglB在降解纤维二糖时存在延迟并且降解速率明显降低,△bglA/bglB完全丧失降解纤维二糖的能力。所有结果表明BglB在C.hutchinsoni 纤维二糖和纤维素降解中起关键作用,BglA可以被诱导产生从而部分弥补△bgl中β-葡萄糖苷酶缺失带来的影响。在纤维素降解方面,所有单敲除菌株均可以降解纤维素,△bglA/bglB无法在液体条件下降解纤维素,但是在固体平板上可以降解滤纸。通过研究发现固体平板中的少量营养物质可以促使△bglA/bglB 降解纤维素,并且在液体条件下外加少量葡萄糖时△bglA/bglB 可以降解纤维素。但△bglA/bglB 缺失β-葡萄糖苷酶活性,在外加葡萄糖条件下仍不能降解纤维二糖。这些结果表明C.hutchinsonii可以通过不需要β-葡萄糖苷酶参与的途径降解纤维素。经过定量分析发现当△ bglAbglB在外加少量葡萄糖条件下降解纤维素时,超过55%的纤维素被转化为纤维二糖,其它部分纤维素被菌体转化为葡萄糖供菌体生长。我们基于离子色谱的手段建立了C.hutchinsonii 细胞外和细胞内纤维寡糖的检测方法。当野生菌体与纤维二糖共同孵育时,短时间内菌体即可将纤维二糖完全转化为葡萄糖并在细胞外大量积累,但在整个过程中细胞体内检测不到纤维二糖和葡萄糖的积累。同时通过酶活测定结果以及Western blot检测发现C.hutchinsonii中β-葡萄糖苷酶既存在于细胞表面又存在于周质空间。由此我们推断外源的纤维二糖在细胞表面降解为葡萄糖后再被菌体利用。长期以来,人们在C.hutchinsonii的发酵液中没有检测到明显的还原糖。我们通过离子色谱的手段成功的在纤维素培养早期检测到明显的葡萄糖积累。另外当野生株菌体与纤维素孵育时,在体外可以检测到大量的葡萄糖以及少量的纤维二糖和纤维三糖积累。同时细胞表而存在β-葡萄糖苷酶和纤维素内切酶,这表明C.hutchinsonii存在细胞表面纤维素降解途径。我们首次在C.hutchinsonii降解纤维素过程中,于细胞内检测到大量的葡萄糖、纤维二糖以及纤维二糖等纤维素降解产物的积累。研究发现细胞外纤维寡糖不容易转运到细胞体内,这表明细胞内降解产物不是由细胞外降解产物转运而来。同时周质空间存在β-葡萄糖苷酶和纤维素内切酶,这表明C.hutchinsonii存在细胞内纤维素降解途径。根据本文中研究结果结合他人的研究成果,我们提出新的C.hutchinsonii纤维素降解模型:1.C.hutchinsonii既可以在细胞表面降解纤维素也可以在周质空间降解纤维素。2.在细胞表面纤维素内切酶在其它蛋白帮助下可以将纤维素降解为纤维寡糖,随后被β-葡萄糖苷酶降解为葡萄糖。3.细胞表面的蛋白可以剥离纤维素链并将其转运到周质空间,并通过纤维素内切酶和β-葡萄糖苷酶降解为葡萄糖4.C.hutchinsoni 可以在没有β-葡萄糖苷酶的参与下部分降解纤维素。在这一部分工作中我们研究了 C.hutchinsoniiβ-葡萄糖苷酶的功能,提出新的双途径降解模型。这提高了我们对C.hutchinsonii纤维素降解机制的认识,使C.hutchinsonii纤维素降解研究不再局限于周质空间,从而使有利于进一步揭示C.hutchinsonii纤维素降解机制。2.纤维素吸附蛋白的鉴定及吸附蛋白CHU_<sub>0344功能的研究C.hutchinsonii独特的纤维素降解途径需要菌体直接与纤维素接触。纤维素吸附蛋白特别是表面吸附蛋白在菌体吸附并降解纤维素过程中起重要作用。本文通过使用TritonX-100抽提破碎细胞释放蛋白质并使其吸附纤维素的方法,得到菌体在葡萄糖和纤维素培养条件下的全细胞的吸附蛋白。经过质谱鉴定得到781个纤维素培养条件下的吸附蛋白和744个葡萄糖培养条件下的吸附蛋白。通过质谱鉴定结果可以近似比较各蛋白相对的表达量。通过比较发现有部分蛋白在葡萄糖和纤维素培养条件下存在明显差异。并且现已发现的影响纤维素降解的几个重要蛋白均位于质谱结果的前100位。Chutchinsonii 纤维素吸附蛋白的鉴定为寻找纤维素降解相关重要蛋白提供了参考。选取表达水平较高并且在纤维素培养条件下存在明显上调的CHU₀344蛋白进行研究。前期研究发现C.HU₀344蛋白既可以定位于细胞膜也可以分泌到细胞外。对chu₀344基因进行敲除,发现敲除株纤维素吸附能力只有野生株的75%左右,并且菌体降解纤维素能力略有降低。这表明CHU₀344蛋白在菌体吸附纤维素过程中起作用,并影响纤维素的降解。3.chu₂1 0基因功能及flexirubin色素生物学功能研究转座子随机插入突变技术是研究功能基因的常用手段。我们通过HimarEm3转座子对C.hutchinsonii进行插入突变,筛选到一株色素合成缺陷菌株。通过反向PCR检测发现插入位点位于chu2110（fabZ）基因。回补基因chu₂110使突变株色素合成表型恢复。fabZ基因编码一个122氨基酸的蛋白。FabZ蛋白（YP₆78715.1）标注为β-羟酰-ACP脱水酶,在蛋白序列的N端有一个FabA_FabZ/hot_dog超家族的保守结构域。通过SignalP4.1预测蛋白没有信号肽,PSORTb预测蛋白定位于细胞质中。β-羟酰-ACP脱水酶通常在II型脂肪酸合成的延伸过程中起所用。本文研究发现β-羟酰-ACP脱水酶FabZ在C.hutchinsonii flexirubin色素的多烯链的合成过程中起作用,在此过程中FabZ催化一个类似脂肪酸合成延伸过程的循环途径。在C.hutchinsonii中含有两个β-羟酰-ACP脱水酶:CHU₂110（FabZ）和CHU₀969（FabA）。其中fabZ位于色素合成相关基因簇中,而fbA位于脂肪酸代谢相关基因簇。在研究发现敲除fabA基因不会影响C.hutchinsonii flexirubin色素的合成。同时发现在已报道的几种产flexirubin色素菌体的色素合成基因簇中包含的均为fabZ基因。色素是微生物的重要次级代谢产物,flexirubin色素是拟杆菌分类学的重要标记,我们研究了拟杆菌flexirubin色素的生物学功能。发现flexirubin色素具有抵抗氧化压力和紫外线照射损伤的功能,这与其它色素功能类似。flexirubin色素的共轭多烯链和其它不饱和键可以发生还原反应从而可以抵抗氧化剂和紫外照射产生的自由基。同时flexirubin色素还具有抵抗碱性条件压力的作用,这一功能尚未在其它色素中报道。