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骨肉瘤(Osteosarcoma)是一种多发于青少年的常见恶性肿瘤,发病率居原发性骨肿瘤的首位,威胁世界各地年轻人。尽管临床诊断和治疗技术的不断发展,但恶性骨肿瘤死亡率与致残率仍然居高不下,多数患者5年生存率在60%左右。深入研究肿瘤分子机制及其治疗方法,为临床骨肿瘤的治疗提供新思路与新方法,有助于提高患者治愈率和生存质量。声动力疗法(Sonodynamic therapy,SDT)是在光动力基础上发展起来的治疗肿瘤新方法,克服光动力治疗穿透性弱的弊端及热效应,发挥声敏剂的特异性聚集及超声治疗的靶向性、无创伤、可重复性、毒副作用小等优势,为临床治疗恶性肿瘤提供了广阔的应用前景。本课题采用低强度超声联合声敏剂5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic Acid,5-ALA)诱导大鼠骨肉瘤细胞(UMR-106)体内外凋亡分子机制开展深入研究。首先采用MTT方法筛选出5-ALA在骨肉瘤细胞中最佳药物浓度、转化为原卟啉IX(Protoporphyrin IX,Pp IX)达到高峰期时间以及最佳超声辐照时间;通过荧光显微镜检测5-ALA在UMR-106细胞中的代谢分布情况;通过Hochest33342染色检测细胞凋亡情况,运用碘化丙啶(Propidine iodide,PI)染色分析细胞坏死,比较各组细胞凋亡率和坏死率;运用Annexin V-FITC/PI染色经激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡形态,并通过流式细胞仪检测细胞存活率;透射电镜观察细胞超微结构变化等。发现在6 h细胞中Pp IX代谢达到高峰期,筛选出5-ALA最佳药物浓度为2.0 m M,超声最佳辐照时间是7 min,低强度超声最佳声强2.0 W/cm2。以2.0 m M 5-ALA处理细胞6 h,以2.0 W/cm2低强度超声辐射细胞7 min,可显著诱导细胞凋亡。在研究细胞发生凋亡机理方面,运用荧光分光光度计检测了细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成,采用荧光探针染色分析了细胞内钙离子浓度的变化,运用JC-1染色检测了线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)改变,发现声动力诱导肿瘤细胞凋亡主要利用超声波穿透性激活组织内Pp IX产生活性氧,引起细胞钙超载,导致细胞膜及线粒体破坏、溶酶体释放等破坏肿瘤细胞核酸分子结构而发挥作用。通过2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)检测到SDT组产生大量ROS,通过钙离子荧光探针Fura-2 AM检测到SDT组细胞内钙离子含量异常升高,通过JC-1检测SDT组出现线粒体膜电位下降,通过Western blot检测相关凋亡蛋白表达情况,发现在SDT组中Bcl相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、细胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C)、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达上调、抑凋亡蛋白B淋巴细胞瘤2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)表达下调,以上检测方法说明SDT诱导骨肉瘤细胞凋亡以内源性线粒体凋亡途径为主。在体外细胞学研究的基础上,本文进一步深入探讨SDT对裸鼠移植瘤的抑瘤效应进行研究。对移植瘤测量发现,在SDT组中移植瘤生长缓慢,通过免疫组化脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick end-labeling,TUNEL)法检测发现肿瘤细胞凋亡增加、增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen,PCNA)检测到细胞增殖受到抑制,而单纯超声组和5-ALA组细胞凋亡率低与对照组相比无明显差异,在SDT治疗肿瘤的周边组织几乎无影响。通过免疫组化染色法检测到Bax、Caspase-3、肿瘤蛋白p53(Tumor protein p53,p53)等基因在SDT组中阳性表达明显增加,抑癌基因Bcl-2表达下调;透射电镜检测发现SDT组中大量肿瘤细胞凋亡,也进一步证明超声激活声敏剂后诱导肿瘤组织细胞凋亡,从而抑制肿瘤生长。综上所述,本研究证实SDT能够诱导骨肉瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长,明确SDT的作用机制是产生大量ROS,通过内源性线粒体凋亡通路诱导骨肉瘤细胞凋亡。鉴于声动力治疗的高度靶向性及无创性,在未来肿瘤治疗领域将发挥十分重要作用。