论文部分内容阅读
目的建立中成药中原料药材的分子鉴别方法。方法(1)选用成药连翘败毒丸为研究对象,提取总DNA,通过PCR反应分别对psbA-trnH和rbcL两个叶绿体序列进行梯度扩增,将扩增产物与pEASYTM-T5 vector连接后,转化到大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中,挑取单克隆,并选择阳性克隆进行测序。所得序列校正、比对后,进行BlastN比对分析,同时采用MEGA 4.0软件构建系统聚类树;(2)选择6种含有金银花原料药材的中成药为对象,提取其总DNA并纯化,以叶绿体trnL-trnF扩增产物作为模板,选择叶绿体特异鉴别引物和FatB鉴别引物进行扩增,测序。所得序列校正、比对后,进行BlastN比对分析;(3)以原料药材丹皮DNA为模板,通过PCR反应分别对5个FAM荧光标记引物psbA-trnH、ITS、trnL-trnF、matK和rbcL序列进行扩增并测序,所得测序结果使用GeneMarker V1.80进行分析。最终选择psbA-trnH荧光标记引物来扩增六味地黄丸及其原料药材;(4)采集不同产地的断肠草药材、金银花、山银花和水银花,所有样品提取总DNA,并对断肠草、金银花、山银花的水提液进行DNA提取。通过对断肠草psbA-trnH片段进行扩增、测序,并搜索Genbank数据库中收录的中金银花类药材基原植物psbA-trnH序列,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。结果(1)通过psbA-trnH序列分析可以鉴定出连翘败毒丸中9种原料药材,rbcL序列分析可以鉴定出6种原料药材;(2)金银花特异鉴别引物扩增分析6种中成药中均含有原料药材金银花,山银花特异鉴别引物扩增分析出金噪开音丸中可能含有山银花。Fat B鉴别引物扩增分析可以鉴定出6种中成药中均含有原料药材金银花,而金嗓开音丸和牛黄清宫丸2种成药中还含有山银花药材;(3)通过psbA-trnH荧光标记引物扩增分析,可以准确鉴定出六味地黄丸中的丹皮,山药,泽泻3种原料药材;(4)通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增,发现断肠草可扩增出97 bp片段,而金银花类药材则不能扩增出条带。结论采用分子标记技术鉴定中成药中原料药材具有一定的可行性。