【摘 要】
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随着全球经济的不断发展,资源紧缺的问题也越发的严峻,而纤维素作为地球上最丰富的可再生资源,如何高效降解纤维素,生成可利用能源成为了目前研究的热点。目前最为绿色环保降解纤维素的方法,是利用纤维素酶及一些辅助酶类酶法降解纤维素,但是降解过程中游离酶存在难以重复利用,稳定性差等问题,限制了酶的应用。本文采用一种新型的有机-无机杂化纳米花固定化技术对纤维素降解酶裂解多糖单加氧酶进行固定化,并研究其固定化酶
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随着全球经济的不断发展,资源紧缺的问题也越发的严峻,而纤维素作为地球上最丰富的可再生资源,如何高效降解纤维素,生成可利用能源成为了目前研究的热点。目前最为绿色环保降解纤维素的方法,是利用纤维素酶及一些辅助酶类酶法降解纤维素,但是降解过程中游离酶存在难以重复利用,稳定性差等问题,限制了酶的应用。本文采用一种新型的有机-无机杂化纳米花固定化技术对纤维素降解酶裂解多糖单加氧酶进行固定化,并研究其固定化酶性质变化。本文分别以磷酸铜、磷酸锌及四氧化三铁三种无机晶体复合物作为固定化载体,对来源于纤维素降解菌Arthrobotrys sp.CX1的LPMO（cx-LPMO-B）进行固定化,形成三种有机-无机纳米固定化酶,对固定化方法及对应的固定化酶性质变化进行研究发现:（1）磷酸铜无机杂化纳米花:在25℃搅拌14 h,120 mmol/L的硫酸铜逐滴加入蛋白量为0.3mg/m L、p H 7.4的磷酸盐溶液的最适固定化条件下,可制备得到cx-LPMO-B-Cu2+NF,通过扫描电子显微镜（SEM）以及投射电子显微镜（TEM）观察cx-LPMO-B-Cu2+NF结构特征,发现其结构呈现分散均匀且单一的盛开花朵状;固定化酶最适反应条件为p H4.0,最适反应温度50℃;对固定化酶酶活进行检测发现固定化酶酶活相比游离酶提高了10%,得到的固定化酶酶活可达28.266 U/mg;且具有一定的储存稳定性;cx-LPMO-B-Cu2+NF在重复使用6次后仍能保持60%以上的酶活,固定化酶重复使用性显著增强,其花状结构增加了其表面积更加有利于对游离酶的固定化。（2）磷酸锌无机杂化纳米花:在25℃搅拌14 h,含有蛋白量为0.6 mg/m L、p H 7.4的磷酸盐溶液中滴加140 mmol/L的硫酸锌可制备得到cx-LPMO-B-Zn2+NF,通过SEM和TEM观察cx-LPMO-B-Zn2+NF结构特征,发现其结构多呈锯齿褶皱状,且呈大量粘性聚合簇状;并使用上述条件对cx-LPMO-B进行固定化后,对固定化酶进行酶活检测,固定化酶反应体系缓冲溶液最适p H为6.0,最适反应温度40℃,发现在反应体系中添加铜离子进行激活后酶活可达70%;该酶同样具有一定的储存稳定性,且cx-LPMO-B-Zn2+NF在重复使用6次后仍能保持45%左右的酶活,使其在工业化应用上具有较高的前景。（3）Fe3O4纳米颗粒:使用多巴胺对四氧化三铁进行涂覆,形成聚多巴胺四氧化三铁纳米粒子,将纳米粒子置于蛋白浓度为1 mg/m L,温度为25℃条件下进行固定化并使用磁力回收后固定蛋白量可达50%,在最适条件下形成cx-LPMO-B-Fe3O4固定化酶,对其进行酶活检测,发现该固定化酶丧失酶活,向反应体系中添加铜离子后其酶活有所提升,但仅为游离酶的10%,酶活相比于以上两种离子形成的固定化酶酶活相对较低。通过实验研究发现,采用金属无机晶体复合物作为载体进行固定化,其方法具有操作简单、条件温和等优点,特别是在对金属依赖酶的固定化上,其对酶活影响较大。
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