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恶性肿瘤严重威胁着人类的生命,给患者带来巨大的经济负担和病痛折磨。乳腺癌为女性常见恶性肿瘤,手术、放疗以及化疗为基本治疗手段,但不良反应大,易产生耐药性,并且对于晚期和已经转移的患者治疗效果差,价格昂贵。因此,开发疗效好,毒副作用低的抗肿瘤药物迫在眉睫。目前对于白头翁抗肿瘤的报道主要集中在复方或者皂苷提取混合物的报道,对于皂苷单体抗肿瘤的研究报道较少。并且对皂苷单体的抗肿瘤转移的作用未见有报道。我们首先对从白头翁分离纯化出的5个皂苷单体进行抗肿瘤作用筛选。得到两个较强的皂苷单体R13和saponin D 。确定了R13的抗肿瘤及抑制转移的作用,并且研究其抗肿瘤及转移的初步机制。目的对己分离纯化得到的白头翁5个皂苷单体saponin D、R13、saponin A、saponinB和β-Hederin进行抗肿瘤作用筛选,确定R13和saponin D的较强抗肿瘤作用。并通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、调控能量代谢、诱导细胞发生自噬对R13和saponin D进行抗肿瘤机制研究。首次研究R13和saponin D的抗肿瘤转移作用及机制。在动物体内验证抗肿瘤及抑制转移的药效。以期寻白头翁皂苷单体抗肿瘤作用的主要有效成分和作用较佳者,为皂苷单体化合物新药开发和临床应用奠定基础。方法第一部分白头翁皂苷抗肿瘤作用有效成分的筛选通过体外细胞实验研究5个单体对人乳腺癌ZR75-1和MCF-7细胞、人肝癌HepG2细胞、人宫颈癌Hela细胞、人结肠癌HCT-116细胞五个细胞的抑制作用,计算抑制率,用Origine软件拟合出皂苷单体对肿瘤细胞的IC50,比较抗肿瘤作用强弱。第二部分 白头翁皂苷单体抗肿瘤增殖作用及其机制研究1.5个单体体外抗肿瘤药效实验：通过体外细胞实验研究5个单体对人乳腺癌ZR75-1和MCF-7细胞、人肝癌HepG2细胞、人宫颈癌Hela细胞、人结肠癌HCT-116细胞进行抗肿瘤药效试验,采用CCK-8法进行检测,绘制肿瘤细胞生长曲线。2.R13和saponin D干预后,乳腺癌细胞ZR75-1和MCF-7进行软琼脂实验和细胞克隆形成实验,观察细胞软琼脂集落形成和克隆形成的情况,并分别计算集落数和克隆数。3.R13和saponin D对细胞周期和细胞凋亡的影响：R13和saponin D处理ZR75-1和MCF-7细胞24h后,各组细胞分别PI染色和Annexin V-FITC/PI双染,用流式细胞仪检测R13和saponin D对细胞周期和细胞凋亡的影响。并且用Western blotting检测周期标志蛋白cyclin D1、cyclin A、cyclin E、P21和P27的表达水平,以及凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP的表达水平。4.R13和saponin D对能量代谢的调控：用R13和saponin D干预ZR75-1和MCF-7细胞24-48h后,按照各试剂盒说明书步骤操作,检测葡萄糖摄取、ATP、PFK、丙酮酸和乳酸。5.R13和saponin D诱导自噬的发生：ZR75-1和MCF-7细胞经Lipofectmine 2000转入GFP-LC3表达载体后,加入R13和saponin D处理细胞,荧光显微镜观察自噬情况和Western blotting检测LCⅡ蛋白表达。第三部分皂苷单体抗肿瘤转移作用及机制研究1.划痕实验和显微镜下观察细胞表型：对5种细胞进行划痕实验,初步筛选5个皂苷单体的抑制转移的作用；镜下观察R13和saponin组细胞的表型。2. Matrigel invasion chambers侵袭实验：用R13和sapinin D干预ZR75-1和MCF-7细胞,结晶紫染色,显微镜下拍照并计数。3.EMT相关蛋白检测：R13和saponin D处理ZR75-1和MCF-7细胞后,Western blotting检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平。第四部分R13单体抗肿瘤作用及转移的动物实验研究1.利用人肝癌HepG2细胞荷瘤裸鼠模型和小鼠乳腺癌4T1细胞荷瘤裸鼠模型,研究R13抑制肿瘤生长的作用。测量瘤块大小,并对瘤块进行Western blotting检测相关周期蛋白、凋亡相关蛋白、EMT标志蛋白、自噬蛋白LCⅡ的表达情况,免疫组化检测活化的caspase-3的表达情况。2.利用小鼠乳腺癌4T1-LUC细胞肺转移模型,研究R13抑制肿瘤细胞转移的作用。用IVIS200活体成像系统观察肺部组织肿瘤形成情况,HE染色观察肺部肿瘤细胞分布情况。结果1.发现在5个细胞系中,R13的IC50最小,在0.54-0.86 ×10-5mol/L之间；saponinD的IC50较R13大,IC50在1.09-1.9310-5mol/L之间。选择R13和saponin D做进一步抗肿瘤作用研究。2.5个皂苷单体对5个肿瘤细胞系生长曲线的绘制,发现R13高、低剂量均显著抑制5种肿瘤细胞的生长,具有统计学意义,p值小于0.05或小于0.01,并且呈剂量效应。R13抑制肿瘤细胞作用,与阳性对照药顺铂一致,高剂量组作用与顺铂相当。saponin D明显抑制五种肿瘤细胞生长,作用较顺铂和R13弱,具有统计学意义,p值小于0.05,呈剂量效应。R13和saponin D对肿瘤细胞抑制作用较正常细胞敏感。3.乳腺癌细胞和肝癌细胞软琼脂集落形成实验充分显示了R13组的细胞生长速度较慢,集落数和克隆数较溶剂对照组control少,具有统计学意义,p值均小于0.05,与阳性药顺铂一致。4.R13和saponin D与顺铂一致,在ZR75-1和MCF-7细胞中,分别都阻滞细胞周期G0/G1期,缩短S期；降低G1/S期标志cyclin D1、cyclin A和cyclin E的蛋白水平,升高P21和P27的蛋白水平；R13的作用较saponin D强。5.R13和saponin D组的凋亡率明显比溶剂对照组control升高,并伴随着Cleaved PARP和Cleaved caspase-3蛋白表达水平的增加,在ZR75-1和MCF-7细胞中。R13作用与顺铂相当。R13对细胞凋亡的作用强于saponin D。6.在ZR75-1和MCF-7细胞中,R13降低葡萄糖摄取量、ATP含量、PFK含量、丙酮酸和乳酸的含量,saponin D降低葡萄糖摄取、PFK含量、抑制乳酸的生成,对ATP和丙酮酸无明显改变。7.R13和saponin D均能促进细胞自噬的发生。R13和saponin D组在显微镜下观察可见自噬小体增加,western blotting检测LCⅡ蛋白表达增加,在ZR75-1和MCF-7细胞中。8.划痕实验和Matrigel invasion chambers侵袭实验表明R13和saponin D抑制细胞的迁移和减少侵袭的数量。显微镜下观察到R13和saponin D组的细胞从细长的纤维样表型成极化的上皮样表型。9.R13对乳腺癌和肝癌荷瘤裸鼠的治疗作用明显,瘤块体积显著小于生理盐水组。R13对乳腺癌转移裸鼠的肺部肿瘤转移明显减少。HE染色显示R13组肺部肿瘤明显减少。R13组相关蛋白的水平的检测结果与体外细胞水平一致。结论R13抗肿瘤作用及抑制转移能力最强,选择性对肿瘤细胞较正常细胞敏感。R13抑制细胞生长通过抑制细胞周期G1/S期转顺、诱导细胞凋亡、调控细胞能量代谢和促进细胞发生自噬实现的。R13的抗肿瘤转移通过抑制EMT的进程来实现。最重要的是,在所有报道的白头翁皂苷单体中,R13抗肿瘤增殖和抗转移的能力是最强的。白头翁为传统中药,资源丰富,R13易于获得,将有可能开发成为治疗非转移期和转移期的乳腺癌的治疗药物。