OVA66是本实验室应用SEREX(SEREX)方法从人卵巢癌cDNA文库筛选得到的一个新的卵巢癌相关基因。该基因含有1752bp的开放读码框，编码583个氨基酸。前期研究发现在大多数肿瘤细胞株中，OVA66基因不仅表达增高，而且发生突变。采用组织芯片结合免疫组化法检测118个组织中OVA66的表达情况，发现在转移性和恶性高的肿瘤组织中，OVA66表达量更高，提示OVA66可能与肿瘤的恶性程度以及转移性有关；经对48例正常人和113例肿瘤病人的血清分析发现，肿瘤患者体内的OVA66抗体水平显著高于正常人；近期研究还发现稳定干扰HeLa细胞中OVA66蛋白的表达能显著抑制该细胞生长、促进凋亡，并且下调HeLa细胞内VEGF、Mdm2和ITGA2等基因表达。本文对肿瘤抗原OVA66生物学特性及相互作用蛋白进行了研究。主要内容如下： ⑴肿瘤抗原基因OVA66生物信息学分析。应用生物信息学方法对OVA66基因及其编码蛋白质进行了一系列的分析。结果表明OVA66基因含有10个外显子和9个内含子，跨度93.37kb，编码蛋白含有一个p23-NUDCD1保守结构域。蛋白同源性分析发现除了与人慢性粒细胞白血病抗原CML66高度同源外，OVA66在小鼠、犬、线虫和果蝇中都有高度同源性的序列存在。多种蛋白亚细胞定位在线软件分析表明，OVA66主要表分布在细胞质。电子Northern杂交分析发现OVA66几乎表达于所有肿瘤类型。应用STRING数据库查找OVA66的相互作用蛋白信息，发现OVA66可能与MMP15、UPAR、S100A4、BOC、TMEM37和EXOSC5等存在相互作用。 ⑵OVA66蛋白亚细胞分布定位。利用本室制备的OVA66单克隆抗体，免疫组化法检测人6类不同恶性肿瘤组织OVA66蛋白表达情况，结果显示特异性棕色反应主要出现在恶性肿瘤细胞胞质区。通过间接免疫荧光法，发现内源性OVA66蛋白在肿瘤细胞HeLa、SW480和正常细胞COS7、HEK293都有一定量表达，主要分布在胞质内。利用增强型荧光报告蛋白EGFP和小分子标签Flag显示OVA66融合蛋白在COS7和HEK293细胞的表达，发现外源性EGFP-OVA66和Flag-OVA66融合蛋白也主要呈胞质分布。Western blot检测HeLa细胞各组份OVA66蛋白的表达情况支持上述结论。通过分子探针结合特异性OVA66单抗，发现在HeLa细胞内OVA66蛋白分别与高尔基体和线粒体存在部分共定位。 ⑶高表达OVA66基因对正常细胞生物学功能的影响。将重组真核表达载体pFlag-OVA66转染子OVA66基因低表达的小鼠成纤维细胞NIH3T3，经G418筛选，获得稳定表达株。经Real-timePCR、Western Blot和FACS分析表明，转基因NIH3T3细胞OVA66 mRNA及蛋白表达明显增高。应用MTT显色法检测转基因细胞生长并绘制生长曲线，证实转染OVA66基因可以促进NIH3T3细胞生长、增殖。平板克隆形成实验也证实，转基因NIH3T3细胞的增殖能力与对照细胞相比明显增强。而且转基因细胞周期发生明显变化，与对照细胞相比，转基因NIH3T3细胞S期细胞比率增高8.65％(12.40％到21.05％)，G1/G0期细胞比率显著降低11.53％(80.32％到68.79％)，G2/M期细胞略有升高2.88％(7.28％到10.16％)。表明OVA66可以使大量细胞进入合成期促进细胞增殖。体外迁徙运动实验发现，OVA66基因可以促进NIH3T3细胞的迁徙运动能力，与对照细胞相比二者有显著性差异(P<0.01)。FACS分析显示高表达OVA66的NIH3T3细胞能够部分抑制5-FU诱导的细胞凋亡。 ⑷相互作用蛋白的筛选与验证。构建pGB-OVA66酵母表达载体，以OVA66蛋白为“诱饵蛋白”，筛选HeLa细胞cDNA文库，寻找OVA66相互作用蛋白。共获得11个与OVA66诱饵蛋白相互作用的阳性克隆，其中9个克隆经测序证实均为衣被蛋白复合体β亚基(Coatomer protein complex，subunitβ1，COPB1)，并且其中8个克隆编码蛋白序列位于COPB1蛋白羧基端。其余两个阳性克隆分别为ATP依赖性RNA解旋酶DHX38(ATP-dependent RNAhelicase DEAD/H box polypeptide38)和DDX3X(ATP-dependent RNAhelicase DEAD box polypeptide3，X-Iinked)o分别构建带有Flag和Myc蛋白表位标签的OVA66和COPB1-C片段(COPB1羧基端270aa)真核表达质粒，两种重组质粒共转染HEK293T细胞，通过琼脂糖微珠EZviewTM Red Protein G Affinity Gel和anti-myc抗体进行免疫复合物共沉淀，以anti-flag抗体进行Western blot检测，确定OVA66和COPB1在哺乳动物细胞内是否存在相互作用。结果显示anti-myc抗体沉淀COPB1-C-myc蛋白同时，OVA66-flag蛋白也一同被沉淀。运用免疫荧光双标记方法对HeLa细胞内COPB1和OVA66蛋白进行共定位分析，以确定两种内源性蛋白是否存在共定位现象。激光共聚焦显微镜观察结果证实COPB1与OVA66两种蛋白在HeLa细胞内存在共定位。从而证实这两种蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用，并且这种相互作用与COPB1蛋白羧基端密切相关。